Визуализация одиночных молекул ДНК репликации с помощью флуоресцентной микроскопии

В данном методе покровные стекла функционализируются смесью инертных молекул ПЭГ и молекул ПЭГ-биотина. С помощью такой функционализированной поверхности создается проточная кювета, которая затем помещается под TIRF-микроскоп. Биотинилированные шаблоны для滾rolling circle amplification (РЦА) прикрепляются к поверхности с помощью мультивалентного стрептавидина.

Когда субстраты реплицируются путем добавления белков зоны репликации и нуклеотидов, полученная двухцепочечная ДНК удлиняется в ламинарном потоке и визуализируется в режиме реальногого времени с использованием интеркалирующего красителя. Здравствуйте, я Нейтан Таннер из лаборатории Антуана Ван Нойена на кафедре биологической химии и молекулярной фармакологии Гарвардской медицинской школы. Я Джо Ларо, также из лаборатории Ван Нойена.

Сегодня мы продемонстрируем методику флуоресцентной визуализации репликации ДНК в режиме реального времени на уровне отдельных молекул. В нашей лаборатории мы используем этот метод для изучения скоординированной активности синтеза ДНК отдельными репликационными комплексами. Итак, приступим.

Для начала данной процедуры проведите отжиг биотинилированного хвоста-олигонуклеотида к одноцепочечной ДНК M 13, добавив десятикратный избыток олигонуклеотида в буфере TBS, нагрев смесь до 65 °C, а затем выключив нагревательный блок для медленного охлаждения, что необходимо для правильного отжига праймера. После подготовки праймера M 13 добавьте его в смесь 64 нМ Т7 ДНК-полимеразы и репликационного буфера T7, содержащего dNDPs и хлорид магния, и инкубируйте реакционную смесь при 37 °C в течение 12 минут. По завершении инкубации остановите реакцию добавлением 100 мМ EDTA.

Затем очистите полученную продукт-ДНК с помощью экстракции фенол-изоамиловым спиртом и хлороформом, после чего проведите диализ в ТЕ-буфере или другом подходящем буфере для хранения; при этом каждую органическую фазу следует экстрагировать повторно для извлечения остатков праймированной M13. После диализа определите концентрацию ДНК с помощью УФ-видимого спектрофотометра. Одна итерация подготовки матрицы позволяет получить достаточное количество матрицы в наномолярной концентрации для проведения от сотен до тысяч экспериментов с единичными молекулами.

Теперь, когда ДНК готова, переходите к подготовке функционализированных покровных стекол. ДНК, подлежащая репликации, прикрепляется к стеклянным покровным стеклам, функционализированным APTES; окси-группа APTES связывается со стеклом, оставляя аминогруппу доступной для связывания с биотинилированными молекулами ПЭГ. Это покрытие помогает снизить неспецифическое связывание с поверхностью.

Для тщательной очистки стеклянных покровных стекол поместите их в окрасочные стаканы и заполните стаканы этанолом, затем обработайте в ультразвуковой бане. Через 30 минут опорожните стаканы и заполните их 1 M раствором гидроксида калия. Снова обработайте в ультразвуковой бане в течение 30 минут, после чего повторите обе стадии промывки. Для проведения первой реакции функционализации необходимо удалить все следы воды.

Наполните стаканы для окрашивания ацетоном и обработайте в ультразвуковой бане в течение 10 минут. Опорожните стаканы и снова наполните их ацетоном. Затем добавьте в стаканы синильный реагент и перемешивайте в течение двух минут.

Затем гасят реакцию большим избытком воды. После этого высушивают покровные стекла, прокаливая их в печи при 110 °C в течение 30 минут. Далее готовят смесь ПЭГ с концентрацией примерно 0,2% масс./об.; используя стеклянный распорку для покровных стекол, чтобы обеспечить их разделение, пипеткой наносят 100 µL смеси на сухое силилизированное покровное стекло.

Сверху поместите второе покровное стекло. Инкубируйте покровные стекла в растворе PEG в течение трех часов. Затем разделите каждую пару покровных стекол и тщательно промойте их водой.

Следите за тем, чтобы покровные стекла находились функционализированной стороной вверх, так как PEG наносится только на одну сторону. В завершение высушите покровные стекла сжатым воздухом и храните их в вакууме в эксикаторе; поверхности остаются стабильными в течение как минимум одного месяца. Таким образом, можно изготовить десятки покровных стекол одной партией и использовать их по мере необходимости.

После подготовки покровных стекол можно приступить к сборке проточной кюветы для эксперимента с отдельными молекулами. Сначала налейте от 20 до 25 мл блокирующего буфера с BSA в десикатор, чтобы удалить пузырьки воздуха перед последующими этапами. Затем разведите 25 µL стрептавидина в 100 µL PBS и распределите раствор по поверхности функционализированного PEG покровного стекла; инкубируйте в течение 20 минут при комнатной температуре для связывания стрептавидина с поверхностным биотином, подготавливая в это время остальные части кюветы.

Пока покровное стекло находится в инкубаторе, отрежьте кусок двухстороннего скотча с защитным слоем с обеих сторон так, чтобы он соответствовал размеру кварцевого предметного стекла, используемого для сборки проточной камеры. Карандашом отметьте на скотче положение отверстий для трубок, чтобы нанести контур проточной камеры. После разметки отверстий обведите их прямоугольником шириной 2 мм.

Этот прямоугольник будет служить проточным каналом, поэтому обязательно сделайте ровные края и оставьте достаточно места вокруг входного и выходного отверстий трубок. Теперь вырежьте marked tape по намеченному контуру, делая ровные и чистые срезы, чтобы клей не выступал в канал. Тщательно очистите кварцевое стекло ацетоном, чтобы удалить остатки клея от конструкции проточной кюветы, использованной в предыдущих экспериментах.

Подберите оптимальное положение контура канала. Снимите защитный слой с одной стороны клейкой основы и осторожно приложите ленту к предметному стеклу. Следите за точностью совмещения ленты, так как входное и выходное отверстия должны оставаться открытыми.

Затем подготовьте отрезки трубок диаметром 0,76 миллиметра для входа и выхода проточной кюветы. Рекомендуется срезать конец трубки под углом примерно 30 градусов, чтобы она не прижималась плотно к дну камеры. Разместите трубки на штативах для пробирок, чтобы их было удобно подсоединить к проточной кювете на следующих этапах.

К этому моменту инкубация покровного стекла завершена. Тщательно промойте водой покровное стекло, покрытое стрептавидином-ENC, и высушите его с помощью сжатого воздуха. Будьте осторожны и не переворачивайте покровное стекло, так как функционализирована только одна его сторона.

Наконец, завершите сборку проточной кюветы, сняв защитный слой скотча с другой стороны и поместив кварцевое стекло на покровное стекло. Слегка нажмите на покровное стекло, чтобы вытеснить воздух, попавший в клеевой слой. Это поможет предотвратить появление пузырьков воздуха в проточном канале.

Герметизируйте боковые стороны камеры эпоксидным клеем. Вставьте обрезанные трубки в отверстия в кварце, зафиксируйте их эпоксидным клеем и дайте высохнуть в течение нескольких минут. После высыхания эпоксидного слоя приступите к блокировке поверхности.

Используя иглу калибра 21 G, пропустите некоторое количество блокирующего буфера Degas через одну из трубок. Промойте систему несколько раз, чтобы удалить пузырьки воздуха, и дайте камере инкубироваться в течение как минимум получаса, прежде чем переходить к эксперименту по репликации единичных молекул.

После того как проточная ячейка была заблокирована, поместите ее на предметный столик микроскопа. Зафиксируйте камеру с помощью зажимов столика, убедившись, что проточный канал выровнен вдоль оси y. Подсоедините выходную трубку проточной ячейки к шприцевому насосу, используя соединительную трубку большего диаметра.

Поместите входной конец трубки в блокирующий буфер и потяните поршень шприца назад, чтобы удалить воздух из трубки. Легкое постукивание по выходной трубке поможет удалить пузырьки воздуха, застрявшие в проточной кювете. Теперь добавьте ДНК: разведите исходный шаблон ДНК до концентрации 25 picomolar в одном миллилитре блокирующего буфера, затем подайте раствор в камеру с умеренной скоростью потока, например 0.025 milliliters per minute, в течение 30 минут для обеспечения достаточного покрытия поверхности ДНК.

После помещения ДНК в камеру удалите избыток ДНК, промыв систему блокирующим буфером в объеме не менее 200 объемов проточной кюветы. Для полного удаления свободной ДНК включите лазер и камеру. Охлажденная ПЗС-матрица должна достичь рабочей температуры перед началом использования.

После смывания избытка ДНК и дегазации буфера для репликации приготовьте реакционную смесь для репликации, содержащую нуклеотиды, DTT, цитоксин и буфер для репликации. Затем добавьте белки и осторожно перемешайте. После этого подайте реакционную смесь в проточную кювету.

Скорость потока здесь должна быть достаточной для растяжения двухцепочечной ДНК в потоковом канале шириной 2 мм и высотой 100 мкм; подходящим значением является 0,04 мл/мин. Подождите около 10 минут, чтобы смесь полностью поступила в камеру.

Переместите поле зрения к краю канала и сфокусируйтесь на адгезивном материале, чтобы убедиться в близости к поверхности для настройки фокуса и начала съемки. Отрегулируйте мощность лазера, фокус микроскопа и угол наклона. Поддерживайте низкую мощность, чтобы избежать фоторасщепления окрашенной ДНК.

Производите съемку с частотой от одного до пяти кадров в секунду в течение нескольких минут, в зависимости от скорости репликации ДНК. Повторите процедуру для получения более длинных траекторий репликации или перейдите в новое поле зрения, чтобы увидеть больше молекул, когда почти вся реакционная смесь будет вымыта из клетки; для осмотра других полей зрения подайте в поток больше буфера с cyt. Получение нескольких изображений различных реплицированных молекул позволяет собрать статистические данные для определения продуктивности.

В анализе репликации по типу «катящегося кольца» синтез ведущей цепи удлиняет хвост, соединяющий кольцо с поверхностью; затем этот хвост превращается в двухцепочечную ДНК с помощью полимеразы запаздывающей цепи и растягивается ламинарным потоком, как показано на видео. Здесь представлен пример поля зрения с использованием Cy3 при возбуждении на 532 нм.

Маленькие флуоресцентные точки представляют собой прикрепленные нереплицированные субстраты. Обратите внимание на экстремальную длину продуктов и их большое количество в одном поле зрения. В типичном поле зрения будет видно множество реплицирующихся молекул в виде растущих ярких линий окрашенной ДНК. В экспериментах с E Coli при 37 °C наблюдается от 5 до 50 молекул на поле зрения в зависимости от плотности покрытия поверхности.

Зона репликации T7 инициируется гораздо эффективнее и реплицирует более 50% молекул в поле зрения. При такой высокой плотности трудно разделить отдельные молекулы, как показано здесь. Поэтому проводите эксперимент с T7 при более низких концентрациях белка или меньшей плотности на поверхности. Графики Chime типичных реплицирующихся молекул в экспериментах с E. coli и T7 включают конечные траектории молекул E. coli и T7, построенные в зависимости от времени; траектории аппроксимированы с помощью линейной регрессии для получения скоростей репликации, которые в данном примере составляют 467,1 п.н./с для E. coli и 99,4 п.н./с для T7.

Для T7 распределения скоростей траекторий отдельных молекул, аппроксимированные одиночными гауссианами, дают среднее значение 535,5 ± 39 п. н./с для E. coli и 75,9 ± 4,8 п. н./с. Для T7 распределения длин продуктов репликации аппроксимированы одиночным экспоненциальным затуханием для определения продуктивности, которая составила 85,3 ± 6,1 т. п. н. для E. coli и 25,3 ± 1,7 т. п. н. для G7. Таким образом, мы продемонстрировали способ измерения координированной репликации ДНК с использованием отдельных молекул.

При выполнении данной процедуры важно помнить о необходимости правильной функционализации покровных стекол и создания чистых прямолинейных микрофлюидных каналов. Обязательно поддерживайте низкую мощность лазерного излучения, чтобы минимизировать фоторасщепление длинных фрагментов DNA. На этом всё.

Благодарим за просмотр и желаем удачи в ваших экспериментах.