Прямое наблюдение Ферменты Репликация ДНК Использование одиночных молекул ДНК Растяжка Пробирной

В данном видео демонстрируется протокол визуализации репликации линеаризированной и химически модифицированной лямбда-ДНК с помощью широкопольной оптической микроскопии. ДНК прикреплена к функционализированному стеклянному предметному стеклу. Свободный конец ДНК помечен микросферой, после чего ДНК растягивается за счет ламинарного потока.

При инициации репликации лидирующая цепь начинает удлиняться, а запаздывающая цепь укорачивается из-за образования петель. Значительная разница в длине двухцепочечной и одноцепочечной ДНК при низких усилиях позволяет напрямую наблюдать преобразования ДНК в процессе репликации. Длина конструкции ДНК контролируется путем отслеживания положения микросферы, что позволяет точно определить скорость и ход репликации ДНК.

Здравствуйте, я Ари Ульрих из лабораторий Антонио Ваниана и Чарльза Ричардсона кафедры биологической химии и молекулярной фармакологии Гарвардской медицинской школы. Сегодня мы продемонстрируем вам методику визуализации репликации ДНК на уровне отдельных молекул. Мы используем эту процедуру в наших лабораториях для изучения ферментативной активности, проявляющейся в процессе синтеза ДНК.

Итак, приступим. В начале данной процедуры линеаризованная ДНК бактериофага Lambda модифицируется путем отжига олигонуклеотидов для формирования репликационной вилки, дополняющего плеча вилки lambda, биотинилированного плеча вилки и праймера вилки. Биотинилированное плечо вилки содержит биотиновый остаток, прикрепленный к его 5'-концу, что позволяет закрепить матрицу ДНК на поверхности проточной ячейки.

ДНК lambda дополнительно модифицируют путем отжига еще одного олигонуклеотида, содержащего фрагмент diggen, который служит высокоаффинным иммунотэгом для прикрепления микросферы. Для создания репликационной вилки необходимо получить ДНК lambda, а также несколько олигонуклеотидов, последовательности которых указаны в письменном протоколе к данному видео. Эти олигонуклеотиды включают биотинилированное плечо вилки, комплементарное плечо вилки lambda, праймер для вилки и комплементарный фрагмент diggen lambda; затем фосфорилируют 5'-концы комплементарного плеча вилки lambda и комплементарного фрагмента diggen lambda с помощью полинуклеотидкинразы T4.

Затем смешайте фосфорилированное комплементарное плечо вилки лямбда-фага, биотинилированное плечо вилки, праймер вилки и ДНК лямбда-фага в молярном соотношении 10 к 10 к 100 к одному. В буфере для Т4-ДНК-лигазы нагрейте смесь при 65 °C в течение пяти минут, затем медленно охладите до комнатной температуры, выключив нагревательный блок, чтобы обеспечить правильный отжиг олигонуклеотидов и связывание Т4-ДНК-лигазы со смесью, и инкубируйте в течение двух часов. При комнатной температуре Т4-ДНК-лигаза катализирует запечатывание одноцепочечных разрывов между олигонуклеотидами и ДНК лямбда-фага.

Наконец, присоедините фосфорилированный λ-комплементарный дигоксигенин-конец к матрице репликации ДНК, добавив фосфорилированный λ-комплементарный дигоксигенин-конец в буфер для T4-лигазы; инкубируйте смесь в течение 30 минут при 45 °C, затем медленно охладите до комнатной температуры, выключив термоблок. Проведите лигирование фосфорилированного λ-комплементарного дигоксигенин-конца с матрицей репликации ДНК, добавив в смесь T4-ДНК-лигазу, и инкубируйте в течение двух часов при комнатной температуре. Теперь готовая матрица репликации ДНК готова к использованию. Чтобы прикрепить активированные магнитные бусины к матрице репликации ДНК, их необходимо функционализировать FAB-фрагментом, специфичным к дигоксигенину.

Для начала этого процесса ресуспендируйте стоковый раствор бусин и перенесите 400 µL в пробирку Эппендорф. Поместите пробирку в магнитный сепаратор и инкубируйте до просветления раствора. Затем удалите супернатант с помощью пипетирования. Чтобы активировать толильные группы для связывания антител, добавьте один миллилитр буфера для связывания и осторожно перемешайте путем пипетирования.

Снова удалите супернатант с помощью магнитного сепаратора. Затем добавьте 240 µL FAB-фрагмента и ресуспендируйте гранулы в 400 µL боратного буфера. Тщательно перемешайте и инкубируйте на ротаторе от 16 до 24 часов при 37 °C.

После инкубации отделите гранулы с помощью магнитного сепаратора и удалите супернатант. Промойте гранулы одним миллилитром промывочного буфера и инкубируйте в течение пяти минут при температуре 4 °C, затем удалите буфер с помощью магнитного сепаратора. Эту процедуру промывки повторите дважды.

Чтобы заблокировать свободные тозильные группы, добавьте один миллилитр BSA в Трис-буфере и инкубируйте в течение четырех часов при 37 °C. После инкубации удалите буфер с бусин с помощью магнитного сепаратора, дважды промойте буфером и разлейте по аликвотам. Для использования ДНК, подлежащая репликации, прикрепляется к стеклянным покровным стеклам, функционализированным амиланном.

Оксигруппа аминосилана связывается со стеклом, оставляя аминогруппу доступной для связывания с биотинилированными молекулами ПЭГ. Данное покрытие способствует снижению неспецифического связывания с поверхностью. Для тщательной очистки стеклянных покровных стекол поместите их в окрасочные стаканы, заполните стаканы этанолом и подвергните ультразвуковой обработке.

В течение 30 минут промывайте флаконы, затем заполните их 1 M раствором гидроксида калия и подвергните воздействию ультразвука в течение 30 минут; повторите обе процедуры промывки. Перед первой реакцией функционализации необходимо удалить все следы воды. Заполните окрашивающие флаконы ацетоном и подвергните воздействию ультразвука в течение 10 минут.

Опорожните флаконы и снова наполните их ацетоном. Добавьте во флаконы синильный реагент и перемешивайте в течение двух минут. Затем погасите реакцию большим избытком воды.

Затем высушите покровные стекла, прокаливая их в печи при 110 °C в течение 30 минут. Далее приготовьте смесь ПЭГ в концентрации примерно 0,2% вес/объем. Биотинилированный ПЭГ, включая спейсер из покровного стекла, позволит разделить покровные стекла; нанесите пипеткой 100 µL на сухое силилизированное покровное стекло.

Поместите сверху второе покровное стекло. Инкубируйте покровные стекла в растворе PEG в течение трех часов. Затем разделите каждую пару покровных стекол и тщательно промойте их водой.

Следите за тем, чтобы покровные стекла находились функционализированной стороной вверх, так как PEG будет нанесен только на одну сторону. В завершение высушите покровные стекла сжатым воздухом и храните их в вакуумном эксикаторе; в таких условиях поверхности остаются стабильными не менее одного месяца. Таким образом, можно изготовить партию из десятков покровных стекол и использовать их по мере необходимости.

После подготовки покровных стекол можно приступить к сборке проточной кюветы для проведения эксперимента с отдельными молекулами. Эксперимент с отдельными молекулами проводится с использованием простой проточной кюветы, сконструированной из функционализированного покровного стекла, двусторонней клейкой ленты, кварцевого предметного стекла и трубок. Для каждого отдельного эксперимента подготавливается одна такая проточная кювета.

Начните со смешивания 5 мл блокирующего буфера и 20 мл рабочего буфера, после чего поместите смесь в десикатор для удаления пузырьков воздуха, которые могут помешать на последующих этапах. Затем нанесите 100 µL рабочего раствора strp din в PBS на поверхность функционализированного ПЭГ-покрытием покровного стекла и инкубируйте в течение 20 минут при комнатной температуре, чтобы strp din связался с поверхностным биотином. Тем временем отрежьте кусок двустороннего скотча по размеру кварцевого предметного стекла и отметьте на скотче места отверстий для трубок.

Наметьте контур поточной камеры, начертив центральный канал шириной 3 мм и прямоугольники, охватывающие оба отверстия. Поточные камеры могут быть сконструированы с двумя Y-образными входными и двумя Y-образными выходными каналами. Теперь вырежьте marked tape по намеченному контуру, выполняя прямые и чистые разрезы, чтобы клей не попал в канал.

Тщательно очистите кварцевую подложку с помощью ацетона, чтобы удалить клей от проточной кюветы, использованной в предыдущих экспериментах. Найдите оптимальное совмещение контуров канала. Снимите защитную подложку с одной стороны и осторожно наклейте ленту на кварцевую подложку.

Следите за тем, чтобы лента была выровнена правильно, так как отверстия для входа и выхода должны оставаться незаблокированными. Затем подготовьте отрезки трубки с внутренним диаметром 0,76 millimeter для входного и выходного отверстий проточной кюветы. Срежьте конец трубки под углом примерно 30 градусов, чтобы трубка не прижималась плотно к дну камеры.

Подвесьте трубки на штативах для пробирок, чтобы их было удобно подсоединить к проточной кювете на следующих этапах. К этому моменту инкубация покровного стекла должна быть завершена. Тщательно промойте покровное стекло водой и высушите его с помощью сжатого воздуха.

Будьте осторожны и не переворачивайте покровное стекло, так как только одна его сторона функционализирована peg. Завершите сборку проточной камеры, сняв защитную ленту с другой стороны и поместив кварцевое стекло на покровное стекло. Слегка нажмите на покровное стекло, чтобы вытеснить воздух, попавший в адгезив. Это поможет предотвратить попадание пузырьков воздуха в проточный канал.

Герметизируйте стенки камеры эпоксидным клеем. Вставьте обрезанные трубки в отверстия в кварце и зафиксируйте их с помощью эпоксидного клея. Дайте высохнуть в течение нескольких минут.

После высыхания используйте иглу 21 калибра, чтобы пропустить часть блокирующего буфера DGAs через одну из трубок для блокирования поверхности камеры. Промойте систему несколько раз, чтобы удалить пузырьки воздуха, и оставьте камеру инкубировать минимум на 30 минут, прежде чем переходить к эксперименту по репликации одной молекулы. После подготовки функционализированных ДНК-матрицей бусин и проточной камеры можно приступать к проведению эксперимента с одной молекулой.

Для начала установите проточную кювету на предметный столик микроскопа. Закрепите камеру зажимами столика, убедившись, что проточный канал совмещен с ПЗС-камерой. Подключите предварительно собранную систему подачи воздуха к шприцевому насосу и к выходным трубкам проточной кюветы.

Используя соединительные трубки большего диаметра, поместите входные трубки проточной кюветы в блокирующий буфер и потяните поршень шприца назад, чтобы удалить пузырьки воздуха из трубок; осторожно постучите по выходным трубкам, чтобы удалить пузырьки воздуха, застрявшие в проточной кювете. После удаления всех пузырьков воздуха перекройте одну из входных трубок иглой, а одну из выходных трубок загерметизируйте, согнув ее на 180 градусов и зафиксировав клейкой лентой. Перед добавлением ДНК в кювету разведите стоковый шаблон ДНК до концентрации 10 picomolar в одном миллилитре 1x блокирующего буфера DGAs. Подайте шаблон в камеру с умеренной скоростью потока для обеспечения хорошего покрытия поверхности ДНК.

Разбавьте стоковый раствор бусин до концентрации от 2 до 4 × 10⁶ бусин на мл в 1 мл 1х блокирующего буфера DGAs. Затем перемешайте смесь на вортексе и обработайте ультразвуком в течение 20 секунд.

Подайте разбавленный раствор микросфер в камеру. После добавления микросфер прекратите поток и дайте системе в камере прийти в состояние равновесия. Затем перекройте обе выпускные трубки.

Любые изменения в трубках при открытой камере вызовут колебания давления, которые создадут сильное воздействие на гранулы и приведут к сдвигу привязанных молекул ДНК. Заблокируйте иглой входную трубку, которая использовалась для загрузки гранул, используя вторую входную трубку. Начните интенсивную промывку проточной кюветы раствором блокирующего буфера DGAs 1x.

Постучите по предметному столику, чтобы удалить все неспецифически прилипшие к поверхности гранулы и проверить результат. Гранулы связаны с ДНК. Попробуйте изменить направление потока.

После достаточного удаления свободных гранул перекройте поток и дайте камере достичь равновесия. Приготовьте свежую реакционную смесь, содержащую белки репликации, как указано в текстовом протоколе. Закройте открытую выходную трубку и переключите входной резервуар на свежеприготовленную реакционную смесь.

Медленно откройте выпускной клапан, чтобы избежать резких перепадов давления, и приступите к ферментативной реакции. Сначала подайте раствор белка в камеру с умеренной скоростью потока для обеспечения эффективного связывания с ДНК. Выключите поток и дождитесь достижения равновесия в камере.

Перекройте выходящие трубки и замените трубку, содержащую реакционную смесь. Используя трубку с промывочным буфером DGAs, промойте камеру для удаления свободных белков после промывки. Снова отключите поток и дайте камере достичь равновесного состояния.

Закройте выходные трубки и замените трубку с промывочным буфером. Используйте трубку с буфером для репликации T7; данный буфер содержит хлорид магния, который инициирует начало реакции репликации. Установите скорость потока 0,012 мл/мин, что соответствует силе тяги 3 пН, воздействующей на ДНК-связки при условиях, описанных в данном протоколе.

Перед началом визуализации поместите постоянный магнит из редкоземельных металлов над проточной кюветой, чтобы предотвратить неспецифические взаимодействия между бусинами и поверхностью. Расположите волоконный осветитель под углом падения от 10 градусов до параллельно предметному столику микроскопа рядом с полем зрения микроскопа с использованием объектива 10x и CCD-камеры. Для повышения контраста при фокусировке изображения бусины с использованием привязанной бусины применяется освещение в темном поле.

Начните сбор данных, осуществляя запись в течение 20–30 минут с низкой частотой кадров. При успешном проведении эксперимента одновременно могут наблюдаться 100 бусин. В результате эксперимента должно быть получено множество трейсов, демонстрирующих синтез ДНК лидирующей цепи.

Для измерения скорости и процессивости расплетания и полимеризации ДНК необходимо определить точные координаты бусин. Аппроксимируйте эти координаты с помощью двумерных функций Гаусса. Визуализируйте траекторию, отслеживая положение бусины в каждом кадре с помощью программного обеспечения для трекинга.

Затем с помощью любого графического программного обеспечения постройте график зависимости положения бусины от времени для получения данных о скорости. Примените к графикам линейную регрессию и рассчитате наклон для процессивности. Определите общую длину ДНК от начала до конца события укорочения.

Объедините все единичные измерения и постройте распределения скорости и продуктивности, аппроксимировав данные с помощью функций Гаусса и одноэкспоненциальных функций соответственно. Мы только что продемонстрировали вам способ измерения скорости и процессивности репликации ДНК на уровне отдельной молекулы. При выполнении данной процедуры важно убедиться, что сила и определенный сдвиг, создаваемые ламинарным потоком, не влияют на ферментативную активность белков репликации.

На этом всё. Спасибо за просмотр и успехов в ваших экспериментах.