Очистка Конкретные популяции клеток путем флуоресцентной Активированный Сортировка Cell (FACS)

Здравствуйте, я Хоуп Кэмпбелл, специалист по проточной цитометрии из Исследовательского института крови при Центре крови Висконсина. Здравствуйте, я СТР Басо, аспирант из лаборатории доктора Бонни Дитер. Я также работаю в Исследовательском институте крови при Центре крови Висконсина.

Сегодня мы проведем процедуру выделения клеток с помощью метода сортировки клеток с флуоресцентной активацией. Мы используем этот метод в лаборатории для изучения функций лимфоцитов и популяций миелоидных клеток. Приступим.

В данной процедуре B- и CD4+ T-клетки будут очищены из спленоцитов мыши. Исходное количество целевых клеток следует рассчитать исходя из необходимого числа клеток и степени выхода при использовании данного метода на аппарате. Типичный выход B- и CD4+ T-клеток составляет 85–90%. В исходной популяции спленоцитов содержится примерно 60–70% B-клеток и 20–30% T-клеток.

Таким образом, если начать со 100 × 10⁶ клеток, перед началом FACS можно будет выделить от 50 до 60 миллионов B-клеток и от 20 до 30 миллионов T-клеток. Растворы и реагенты, необходимые для протокола, следует поместить на лед. К ним относятся: буфер для окрашивания, состоящий из фосфатно-солевого буфера с 3% фетальной тесья сыворотки; буфер для суспензии, состоящий из 25 мМ HEPES, приготовленного в сбалансированном солевом растворе Хэнкса (HBSS) с 3% фетальной тельей сывороткой; раствор 25 мМ HEPES, приготовленный на фетальной тельей сыворотке; антитела для окрашивания и компенсационные гранулы.

Для данного протокола также потребуются следующие расходные материалы и реагенты: конические пробирки объемом 15 мл, полистирольные или полипропиленовые пробирки для проточной цитометрии размером 12 × 75 мм. Также следует заранее подготовить нейлоновый фильтр для клеток, трипановый синий, гемоцитометр и пробирки для сбора отсортированных клеток.

Добавьте 300 µL раствора HEPES-FCS в пробирки для проточной цитометрии или 1 мл раствора HEPES-FCS в конические пробирки объемом 15 мл. Их следует держать на льду до начала процесса сбора. Начните с приготовления суспензии одиночных клеток из искомой популяции клеток.

Если клетки, выделенные с помощью данной процедуры, будут культивироваться, весь процесс подготовки клеток следует проводить в ламинарном шкафу для культур тканей. Используя стерильную технику, промойте клетки один раз, добавив ледяной буфер для окрашивания, и ресуспендируйте клетки, несколько раз перевернув пробирку.

Затем центрифугируйте клетки в течение семи-восьми минут при температуре 4 °C со скоростью примерно 250 ×g. Условия промывки могут варьироваться в зависимости от типа и концентрации клеток. Для цитов промойте до 200 × 10⁶ клеток 10 мл окрашивающего буфера.

Осторожно удалите супернатант путем аспирации, чтобы осадок клеток остался неповрежденным. Затем ресуспендируйте клетки в ледяном буфере для окрашивания до концентрации до 50 × 10⁶ на 100 µL. Ресуспендируйте клеточный осадок, слегка постукивая по трубке или аккуратно перемешивая ее на вортексе.

Затем перенесите от 0,25 до 1 × 10⁶ клеток из шести лунок в новую полистирольную или полипропиленовую пробирку для проточного цитометра размером 12 × 75 мм на льду. Отставьте её для последующего использования в качестве неокрашенного контрольного образца. В первую пробирку добавьте первичные антитела в суспензию клеток для достижения требуемой конечной концентрации. В данном случае для окрашивания B-клеток используются антитела anti-B220, конъюгированные с PE-Texas Red, а для окрашивания T-клеток — антитела anti-TCR β, конъюгированные с ZEad, и/или антитела anti-CD4, конъюгированные с APC-700. Перемешайте, постукивая по дну пробирки или легким встряхиванием.

После перемешивания на вортексе поместите клетки на лед и инкубируйте в темноте от 20 до 30 минут. После инкубации промойте меченые клетки с помощью Resus, суспендировав их в 10 миллилитрах ледяного буфера для суспензирования, и центрифугируйте, как было описано ранее, предварительно осторожно удалив супернатант. Повторите этот шаг, чтобы промыть клетки второй раз.

Наконец, ресуспендируйте клетки в ледяном буфере для суспензии. Если первичные антитела не конъюгированы напрямую с флуорофором, добавьте к клеточной суспензии меченые вторичные антитела или конъюгат стрептавидина, после чего снова инкубируйте клетки на льду в темноте в течение 20–30 минут. Промойте клетки дважды ледяным буфером для суспензии.

После ресуспендирования клеток в ледяном буфере для суспендирования определите концентрацию и жизнеспособность клеток, используя витальный краситель, такой как трипановый синий, и гемоцитометр. Доведите концентрацию клеток до 10–20 × 10⁶ клеток/мл, добавив буфер для суспендирования, чтобы избежать засорения проточного цитометра скоплениями клеток, которые могли погибнуть в процессе изоляции.

Процедура и окрашивание. Непосредственно перед началом протокола сортировки профильтруйте клетки через капельный фильтр. Размер пор фильтра следует выбирать в зависимости от типа клеток; для цитов используется фильтр с размером пор 40 µm.

Соберите отфильтрованные клетки в коническую пробирку объемом 15 мл или в пробирки для проточной цитометрии размером 12 × 75 мм, в зависимости от объема. Поместите клетки на лед на время настройки цитометра для проведения сортировки. При использовании калибровочных частиц BD comp beads в качестве одноцветных положительных контролей подготовьте по одной контрольной пробирке для каждого цвета, используемого в анализе, а также пробирку с неокрашенным отрицательным контролем.

После тщательного перемешивания суспензий магнитных частиц на вортексе добавьте по одной капле каждой суспензии отрицательных и положительных частиц в 100 мкл суспензионного буфера для каждого используемого красителя и для отрицательного контроля. Затем добавьте по 1 мкл меченого антитела в каждую пробирку с положительным контролем. В данном эксперименте одна пробирка готовится с использованием антител PE Texas Red B 20.

Смешайте одну пробу с антителами fit ETCR beta и одну пробу с антителами lor 700 CD four, аккуратно постукивая по дну пробирок, и инкубируйте от 15 до 30 минут в темноте при комнатной температуре. Промойте бусины один раз 2 мл окрашивающего буфера и центрифугируйте при 200 Gs в течение 10 минут. Удалите супернатант путем аспирации и ресуспендируйте осадок бусин в 200–500 µL окрашивающего буфера.

Настройка буферной системы проточного цитометра зависит от производителя и должна выполняться только квалифицированным персоналом. Процедура сортировки клеток в данном случае будет выполняться с использованием системы BD FACS Aria. Перед началом сортировки выберите подходящую насадку сопла в зависимости от типа сортируемых клеток.

Доступные размеры сопел составляют 70 мкм, 100 мкм и 130 мкм. Размер сопла должен быть как минимум в три раза больше размера сортируемой клетки; для лимфоцитов выбирается сопло размером 70 мкм. Асептическая сортировка клеток может быть выполнена с помощью функции асептической сортировки прибора.

При использовании этого варианта весь путь обтекателя деконтаминируется 70% ethanol в соответствии с инструкциями производителя. Обязательно замените фильтры обтекателя и замените PBS на стерильный PBS. Когда цитометр будет готов к работе, поместите предварительно охлажденные пробирки для сбора, содержащие heaps FCS, в соответствующее устройство для сбора.

Доступные устройства для сбора могут вмещать до двух конических пробирок объемом 15 мл. Также они могут вмещать четыре пробирки размером 12 × 75 мм или четыре микроцентрифужные пробирки. Используйте пробирки 12 × 75 мм для сбора менее 1,5 × 10⁶ клеток и конические пробирки объемом 15 мл для сбора от 1,5 × 10⁶ до 4,5 × 10⁶ клеток.

Поместите соответствующий приемный сосуд в камеру сбора сортируемых клеток. При многоцветной сортировке направьте боковые потоки в установленный приемный сосуд. Сначала необходимо откалибровать цитометр, чтобы учесть спектральное перекрывание между детекторами.

Приведенный здесь пример иллюстрирует перекрытие спектров испускания fit E и pe. Это перекрытие, показанное темно-закрашенной областью, называется перетоком (spillover). В данном случае переток PE будет регистрироваться в канале fit E, а переток fit e — в канале PE.

Для устранения остаточной флуоресценции одного флуорофора в другом канале необходимо провести коррекцию этого перекрытия. Процесс коррекции перекрытия спектров называется компенсацией. Для выполнения ручной компенсации используйте программное обеспечение для цитометрии, чтобы создать шаблон, включающий двумерный график для отображения прямого светорассеяния FSC и бокового светорассеяния SSC, а также по одной гистограмме для каждого используемого флуорофора.

Метод построения этих графиков зависит от используемого программного обеспечения. Поместите пробирку с отрицательным контролем в загрузочный порт цитометра и начните сбор данных во время прогона образца. Отрегулируйте FSC и SSC так, чтобы интересующая популяция клеток находилась в пределах шкалы.

Затем отрегулируйте настройки ФЭУ флуоресценции так, чтобы негативная популяция или автофлуоресценция находились в крайней левой части гистограммы. Запишите данные пробирки с отрицательным контролем. Извлеките пробирку с отрицательным контролем из порта загрузки цитометра и замените ее первой пробиркой с положительным контролем.

Теперь начните сбор данных. Повторите этот процесс для каждой пробирки с положительным контролем, регистрируя данные для каждой из них. Для каждого положительного контроля создайте интервальный гейт или прямоугольную область вокруг событий, зафиксированных на гистограмме.

Затем проведите еще один интервальный гейт в области негативной части гистограммы. При выполнении ручной компенсации учитывайте каждый флуорохром, использованный в эксперименте, регулируя медиану положительных событий до тех пор, пока она не станет равной медиане отрицательных событий. Для корректировки медианы изменяйте значения спектрального перекрытия (в сторону увеличения или уменьшения), пока медианы для каждого флуоресцентного параметра не совпадут максимально точно.

Используя настройки, установленные на образцах положительного и отрицательного контроля, подготовьтесь к процедуре сортировки, определив параметры гейтов для экспериментального образца. Поместите пробирку с клетками, подлежащими сортировке, в порт загрузки цитометра и начните сбор данных со скоростью от 9 000 до 10 000 событий в секунду. Выберите диаграмму рассеяния (dot plot) для отображения прямого светорассеяния (forward scatter) относительно бокового светорассеяния (side scatter).

Прямое светорассеяние служит общим индикатором размера клеток и располагается на оси X, в то время как боковое светорассеяние указывает на гранулярность клеток и располагается на оси Y. Теперь выделите гейтом интересующую популяцию. После определения гейтов убедитесь, что температура загрузочного порта цитометра установлена на четыре градуса Celsius.

Затем поместите пробирку с экспериментальным образцом в порт загрузки. Нажмите опцию сортировки и начните сбор данных; пробирки для сбора следует держать на льду по мере их заполнения. Продолжайте сортировку до тех пор, пока не будет собрано нужное количество клеток или пока пробирка с образцом не опустеет.

Затем остановите сортировку, снова нажав кнопку сортировки, и извлеките образец из загрузочного порта. После этого поместите пробирку для сбора непосредственно в загрузочный порт цитометра и зарегистрируйте от 500 до 1000 событий. При использовании тех же настроек, что и при сортировке T-клеток, процедура сортировки позволила повысить чистоту с 21 до 99%. Для B-клеток исходная популяция B-клеток в 5% была увеличена до 98% после сортировки.

Таким образом, мы продемонстрировали вам способ очистки популяций B- и T-лимфоцитов из лейкоцитов с помощью FACS. Помните, что FACS можно использовать для очистки любой популяции клеток, если удается получить суспензию одиночных клеток и имеются соответствующие антитела. Кроме того, клетки, генетически меченные флуоресцентными маркерами, могут быть легко очищены без использования антител.

Также всегда помните о необходимости использования надлежащего контроля в ваших экспериментах и всегда проверяйте конфигурацию лазеров вашего проточного цитометра, чтобы убедиться в правильном подборе флуорохромов, а также используйте соответствующие гейты, чтобы они правильно охватывали ваши популяции. На этом всё. Спасибо за просмотр и удачи в ваших экспериментах.