Флуоресценция активированных сортировки клеток для очистки плазмоцитов дендритных клеток из костного мозга мыши
4 ноября 2016 г.
Мы сообщаем протокол с помощью флуоресцентной-Активированный сортировки клеток, чтобы изолировать плазмоцитов дендритные клетки (PDC) с высокой степенью чистоты из костного мозга волчаночного склонной мышей для функциональных исследований Pdc.
Общая цель этого эксперимента заключается в выделении плазмоцитоидных дендритных клеток, или ПДК, с высокой степенью чистоты из костного мозга мышей, склонных к волчанке, для изучения их функции. Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы, связанные с характеристиками конкретной популяции иммунных клеток, таких как продуцирование интерферона альфа PDC на поздней стадии развития волчанки. Основное преимущество этого метода заключается в том, что от одной до нескольких целевых популяций могут быть обогащены до более высокой чистоты, чем с помощью магнитной сортировки шариков.
После сбора урожая переложите кости задних конечностей и четыре миллилитра полной среды в ступку. Добавьте шесть миллилитров свежей готовой среды, чтобы довести общий объем до 10 миллилитров. И аккуратно разломайте косточки пестиком.
Аккуратно помешивайте пестиком, чтобы освободить костный мозг. Затем перелейте всю среду через ситечко 70 микрон в коническую пробирку объемом 50 миллилитров на льду. Добавьте в раствор 10 миллилитров свежей готовой среды.
И процедите надосадочную жидкость еще два раза, пока кости не станут белыми. Затем центрифугируйте клетки костного мозга и повторно суспендируйте гранулу в 10 миллилитрах свежей готовой среды. Затем нанесите слой клеток на пять миллилитров свежеприготовленной градиентной среды плотности в коническую пробирку объемом 15 миллилитров, стараясь не нарушить слои.
И разделить клетки путем центрифугирования. Затем осторожно удалите верхние восемь миллилитров раствора, а два миллилитра наберите охристый слой в промежутке фаз. Добавьте 12 миллилитров ледяной полной среды к изолированным мононуклеарным элементам и закройте пробирку для перемешивания методом инверсии.
Затем гранулируйте клетки центрифугированием. Чтобы окрашивать клетки для FACS, повторно суспендируйте их в 100 микролитрах CD1632FC блокирующего антитела при четырех градусах Цельсия. Через 10 минут промойте клетки в четырех миллилитрах ледяного сортировочного буфера и пометьте клетки 100 микролитрами соответствующего коктейля антител, окрашивающих клеточную поверхность.
В течение 15 минут при четырех градусах Цельсия в темноте. Промойте клетки в четырех миллилитрах ледяного сортировочного буфера, чтобы удалить любые несвязанные флуоресцентные конъюгированные антитела. Затем повторно суспендируйте гранулу в 500 микролитрах раствора для загрузки FACS и переложите образец в пробирку FACS на льду.
Для окрашивания компенсационного контроля необходимо использовать аликвоту один умножить на 10-шестую спленоциты на пробирку. Промойте ячейки четырьмя миллилитрами сортировочного буфера и повторно суспендируйте гранулы в 100 микролитрах сортировочного буфера. Затем добавьте соответствующее флуоресцентное сопряженное антитело из коктейля антител поверхности главной клетки в каждую соответствующую компенсационную пробирку и встряхните пробирки для смешивания.
Через 15 минут в темноте, при температуре четыре градуса Цельсия, промойте все образцы с помощью сортировочного буфера и снова суспендируйте гранулы в 500 микролитрах ледяного сортировочного буфера. За исключением трубки DAPI, которая повторно суспендирована в 500 микролитрах загрузочного раствора FACS. Для очистки популяции клеток-мишеней с помощью сортировки флуоресцентно активированных клеток загрузите пробирки для сбора, содержащие 500 микролитров FBS с добавлением антибиотиков, ниже сортировочных клапанов.
Затем загрузите неокрашенную трубку и соберите 10 000 событий, чтобы установить отрицательный вентиль для каждой интенсивности флуоресценции. И 10 000 событий в одиночных пробирках компенсации пятен для установки положительного затвора для каждой интенсивности флуоресценции. Соберите 3 000 событий из экспериментальной выборки, чтобы задать вентили отсортированной популяции клеток.
Использование интенсивностей флуоресценции в качестве параметров графика доступа по X и Y для ручного определения популяции клеток-мишеней. Затем отсортируйте целевую популяцию клеток в пробирку для сбора. В конце сортировки добавьте в ячейки до четырех миллилитров ледяной капусты в полном составе.
Затем закройте пробирку крышкой и перемешайте ячейки методом инверсии. Очистите очищенные клетки методом центрифугирования, отасунув все, кроме последних 200 микролитров надосадочной жидкости. Затем повторно суспендируйте гранулу в одном миллилитре ледяной полной среды и перенесите ячейки в микроцентрифугу объемом 1,5 мл для второго центрифугирования.
Наконец, аспирируйте все, кроме последних 100 микролитров надосадочной жидкости, и храните отсортированную клеточную популяцию на льду до использования. Магнитно-активированная сортировка плазмоцитоидных дендритных клеток костного мозга мышей, склонных к волчанке, дает чистоту всего 7,75% после обогащения. Обогащенные FACS плазмоцитоидные дендритные клетки, однако, демонстрируют чистоту до 96,4% после сортировки.
Для обеспечения высокой чистоты мононуклеарные клетки костного мозга сначала затворяются и отделяются от мусора по параметрам прямого и бокового рассеяния. Используя зависимость ширины прямого рассеяния от высоты прямого рассеивания и ширину бокового рассеивания от высоты бокового рассеивания, отдельные ячейки дополнительно стробируются, чтобы избежать ложноположительных сигналов, производимых агрегатами. Затем живые одиночные DAPI-отрицательные клетки гейтируются их CD11c-положительной, CD11B негативной экспрессией клеточной поверхности, что позволяет в дальнейшем гейтировать B220-положительную, PDCA-1-положительную целевую популяцию плазмоцитоидных дендритных клеток костного мозга.
Отсортированная популяция PDC не только имеет высокую чистоту, но и функционально нормальна со способностью продуцировать IFNalpha при стимуляции CPG in vitro. Пытаясь выполнить эту процедуру, важно помнить о том, что нужно хрустить кости и осторожно размешивать высвобожденный костный мозг, чтобы сохранить жизнеспособность клеток. После этой процедуры могут быть выполнены другие методы, такие как секвенирование РНК или культивирование и стимуляция in vitro, чтобы ответить на дополнительные вопросы об экспрессии генов или функции обогащенных клеточных популяций.
После своего развития этот метод проложил путь исследователям PDC к изучению роли этой мощной клетки в развитии мышиных моделей, склонных к волчанке. После просмотра этого видео у вас должно сложиться хорошее представление о том, как выделить высокоочищенную популяцию PDC из костного мозга мышей, склонных к волчанке.
Просмотрите полный транскрипт и получите доступ к тысячам научных видео
Обзор
В данной работе представлен протокол выделения плазмоцитоидных дендритных клеток (pDC) из костного мозга мышей, предрасположенных к развитию системной красной волчанки, с использованием метода сортировки клеток с помощью флуоресцентно-активированного цитометра. Целью данного метода является достижение высокой степени чистоты выделенного материала для последующих функциональных исследований pDC.
Основные компоненты исследования
Область науки
- Иммунология
- Клеточная биология
- Аутоиммунитет
Теоретические основы
- Плазмацитоидные дендритные клетки играют ключевую роль в иммунных ответах.
- Они вырабатывают интерферон альфа, особенно при прогрессировании системной красной волчанки.
- Высокая степень чистоты при выделении клеток необходима для точного функционального анализа.
- Сортировка клеток с помощью флуоресцентно-активированной сортировки обладает рядом преимуществ перед традиционными методами.
Цель исследования
- Для выделения pDC из мышей, предрасположенных к системной красной волчанке.
- Для изучения функциональных характеристик pDC.
- Для углубления понимания поведения иммунных клеток при системной красной волчанке.
Используемые методы
- Забор костного мозга у мышей, предрасположенных к системной красной волчанке.
- Использование флуоресцентно-активированной сортировки клеток для изоляции.
- Приготовление полной среды для обработки клеток.
- Дробление костей для высвобождения клеток перед сортировкой.
Основные результаты
- Успешное выделение pDC с высокой степенью чистоты.
- Углубленное понимание функции pDC при системной красной волчанке.
- Продемонстрированные преимущества сортировки клеток с помощью флуоресцентно-активированного сепаратора.
- Разработка надежного протокола для последующих исследований.
Выводы
- Данный протокол позволяет эффективно изолировать pDC для функциональных исследований.
- Полученные результаты способствуют пониманию патологии системной красной волчанки.
- Будущие исследования могут опираться на данную методологию.
Часто задаваемые вопросы
Практическая значимость для отрасли
Изоляция редких популяций иммунных клеток с высокой степенью чистоты имеет решающее значение для снижения механистических рисков при валидации мишеней и разработке доклинических моделей. Флуоресцентная сортировка клеток (FACS) позволяет точно разделять плазмоцитоидные дендритные клетки из костного мозга мышей, предрасположенных к развитию волчанки, что обеспечивает надежное проведение функциональных анализов и поиск трансляционных биомаркеров. Этот подход снижает уровень биологического шума на ранних этапах исследований, повышая прогностическую достоверность при последующей проверке терапевтических гипотез.
Стратегическое применение в биофармацевтических исследованиях и разработках
Первичный поиск и валидация мишени
- Научная ценность: позволяет исследовать функцию плазмоцитоидных дендритных клеток в патогенезе системной красной волчанки путем выделения чистой популяции для изучения продукции интерферона альфа.
- Практическая ценность: обеспечивает чистоту до 96,4% после сортировки, что значительно превосходит альтернативные методы магнитной сепарации клеток.
- Стратегическая ценность: повышает достоверность данных по мишеням за счет снижения клеточной гетерогенности при анализе функциональных показателей, что помогает в принятии решений о продолжении или прекращении разработки (go/no-go) при скрининге иммуномодуляторов.
Скрининг и разработка анализа
- Научная ценность: Позволяет получать очищенные плазмоцитоидные дендритные клетки, подходящие для анализов стимуляции in vitro, таких как измерение уровня интерферона альфа, индуцированного CpG.
- Операционная ценность: Обеспечивает одновременное разделение нескольких популяций клеток, что повышает пропускную способность экспериментов и стандартизацию анализа.
- Стратегическая ценность: Создает воспроизводимый исходный материал для рабочих процессов скрининга, что позволяет проводить надежную оценку соединений в отношении определенных иммунных фенотипов.
Трансляционные и доклинические исследования
- Научная ценность: Представляет релевантную для заболевания систему с использованием моделей мышей, предрасположенных к системной красной волчанке, для изучения вклада плазмоцитоидных дендритных клеток в развитие аутоиммунитета.
- Практическая ценность: Изолированные клетки сохраняют нормальную функциональную активность и способны вырабатывать интерферон альфа при стимуляции, что подтверждает их пригодность для анализа.
- Стратегическая ценность: Обеспечивает трансляционную преемственность от этапа открытия до доклинической валидации путем предоставления хорошо охарактеризованных первичных клеток для исследований механизмов действия.
Интеграция конвейера и рабочего процесса
Данный метод вписывается в континуум процесса поиска новых лекарственных средств, обеспечивая раннюю валидацию мишеней посредством фенотипического скрининга и позволяя идентифицировать ведущие соединения с помощью функционального анализа очищенных иммунных клеток.
- Фундаментальная биология: Поддерживает проверку гипотез путем выделения плазмоцитоидных дендритных клеток для выяснения их роли в патологии волчанки, вызванной интерфероном.
- Скрининг: Обеспечивает получение стандартизированных высокочистых популяций клеток для воспроизводимых функциональных анализов и скрининга соединений.
- Аналитика: Позволяет проводить количественные измерения зависимых переменных, таких как выработка цитокинов, данные проточной цитометрии и оценка чистоты с помощью гейтирования по прямому и боковому рассеянию.
- Трансляционные исследования: Обеспечивает преемственность с доклиническими исследованиями за счет использования мышей, предрасположенных к волчанке, что соответствует механистическому снижению рисков в моделях аутоиммунных заболеваний.
- Корпоративное повторное использование: Создает возможность многократного применения метода выделения редких иммунных клеток в различных проектах по иммунологии и аутоиммунитету.
Операционное и корпоративное влияние
- Научная ценность: Повышение достоверности прогнозов за счет снижения механистической неопределенности в исследованиях функций иммунных клеток.
- Операционная ценность: Стандартизация и воспроизводимость благодаря определенным стратегиям гейтирования и контролю компенсации.
- Стратегическая ценность: Оптимизация принятия решений о целесообразности дальнейшей разработки (go/no-go) и снижение биологических рисков на поздних этапах разработки иммуномодуляторов.
- Влияние на портфель: Приоритизация с учетом рисков на основе надежных доклинических данных, полученных из очищенных популяций клеток.
Особенности реализации
- Требуется опыт работы в области проточной цитометрии, окрашивания клеток и контроля компенсации для точного проведения флуоресцентно-активированной сортировки клеток.
- Зависимость от оборудования, включая проточные цитометры, системы сортировки и центрифуги для обработки костного мозга.
- Необходима межгрупповая стандартизация панелей антител, стратегий гейтирования и протоколов сортировки между группами иммунологии и разработки анализов.
- Требуется учитывать особенности адаптации при применении протокола к другим модельным системам или источникам тканей, помимо костного мозга мыши.
- Включает практические ограничения, такие как необходимость бережного разрушения костного мозга для сохранения жизнеспособности клеток и трудоемкость многоэтапной очистки.
