Аортального кольца Пробирной
24 ноября 2009 г.
Ангиогенез, прорастание кровеносных сосудов из уже существующих сосудистой сети, связано как с естественными и патологических процессов. Здесь мы показываем, аортального кольца анализа, который позволяет ангиогенных усилителей и ингибиторов быть непосредственно добавлен аортального кольца в культуре. Проросшие и neovessel результат может быть определена путем проверки аортального кольца в течение 6-12 дней.
Общая цель анализа аортального кольца заключается в создании гибкой экспериментальной системы, в которой происходит прорастание кровеносных сосудов из целых фрагментов аорты мыши внутри трехмерного матрикса. Это достигается путем предварительного выделения грудной аорты из организма мыши с последующим тщательным удалением всех остатков окружающих тканей. Срезы очищенной аорты или аортальные кольца помещают в отдельные лунки 48-луночного планшета, в каждой из которых находится базовый экстракт матрикса (BME), сформированный в виде куполов.
Дополнительная капля BME заключает кольцо в трехмерную структуру. Матрикс может содержать любой выбранный экспериментальный реагент. После инкубации в течение нескольких дней можно наблюдать прорастание сосудов из колец аорты, что позволяет оценить ангиогенный потенциал исследуемых соединений.
Здравствуйте, я Карен Бейн из лаборатории доктора Э. Льюиса на кафедре клинической биохимии Университета Беон в Беэр-Шеве, Израиль. Сегодня мы продемонстрируем вам методику анализа кольца аорты мыши. В нашей лаборатории мы используем эту процедуру для изучения влияния различных веществ на формирование кровеносных сосудов.
Итак, приступим. Для начала данной процедуры дайте экстракту базальной мембраны (BME) разморозиться на льду или при температуре 4 °C. После размораживания продолжайте хранить BME в охлажденном состоянии, чтобы предотвратить его повторное затвердевание.
В день проведения эксперимента подвергните эвтаназии мышь в возрасте шести-семи недель путем стандартной инъекции кетамина и ксилазина, проведите быстрый кровопуск через сонные артерии с последующим переломом шейного позвонка. Начните процедуру с протирания животного 70% ethanol в стерильном ламинарном шкафу. Затем, работая под dissecting scope, с помощью стерильного пинцета и диссекционных ножниц выполните вертикальный разрез кожи и вскройте брюшную стенку.
Необходимо сделать разрез, чтобы обнажить верхнюю часть грудины, после чего следует разрезать грудную клетку и удалить диафрагму. Аккуратно отодвиньте все органы в сторону, чтобы полностью обнажить грудную аорту, расположенную вдоль позвоночника. Когда аорта станет доступна, введите тонкий стерильный пинцет между аортой и позвоночником. Раскройте пинцет и постепенно приподнимите аорту, отделяя грудной сегмент от остальной части аорты.
После отделения аорты с помощью острых ножниц отсеките ее от мыши, начиная с конца, расположенного рядом с почечными сосудами, и заканчивая в области сердца. Поместите иссеченную грудную аорту в чашку Петри с холодным стерильным PBS. После извлечения аорты можно подготовить аортальные кольца, используя два стерильных пинцета и работая под бинокуляром.
Очистите грудную аорту от окружающей жировой ткани. Следите за тем, чтобы не повредить аорту, и удерживайте ее только за края. Для предотвращения дегидратации в процессе очистки аорту следует неоднократно погружать в чашку Петри с PBS.
Теперь, когда грудной отдел аорты очищен, с помощью хирургического лезвия под бинокуляром равномерно нарежьте аорту кольцами шириной 1 мм. Чтобы обеспечить точность нарезки, используйте линейку, помещенную под поверхность резания; обязательно используйте новое лезвие и периодически заменяйте его для поддержания остроты. Концы аорты не используются. После вырезания каждого кольца осторожно перенесите его пинцетом в новую чашку с холодным PBS.
Поместите все кольца в одну и ту же чашку с PBS, чтобы обеспечить рандомизацию анализа. Поскольку каждый сегмент аорты обладает несколько разным ангиогенным потенциалом, держите кольца на льду. Затем подготовьте планшет для анализа, используя предварительно охлажденные наконечники для дозатора.
В каждую лунку 48-луночного планшета добавьте примерно одну каплю 150 µL холодного BME; капля затвердевает, принимая форму купола в процессе нанесения. BME обеспечивает транспорт веществ, хемотаксис клеток и, что наиболее важно, дифференцировку и миграцию клеток, что приводит к формированию неососудов; периферические лунки заполняют PBS. Чтобы предотвратить дегидратацию BME, дайте капле BME затвердеть при 37 °C в течение 20–30 минут. После затвердевания BME осторожно извлеките кольцо аорты из чашки Петри с помощью пинцета; чтобы избежать повреждений, кольцо следует переносить внутри капли липида, которая образуется между кончиками пинцета. Благодаря поверхностному натяжению жидкости поместите одно кольцо аорты в верхний центр каждого купола и инкубируйте в течение 10 минут при 37 °C. Сверху на каждое кольцо добавьте еще 150 µL BME и инкубируйте в течение 20–30 минут.
При 37 °C кольцо теперь погружено в BME и раствор для анализа. В лунку можно добавить материалы для запуска анализа. Предварительно дополните безсывороточную среду для человеческих эндотелиальных клеток либо исследуемым материалом, либо добавкой для роста эндотелиальных клеток в качестве положительного контроля, либо используйте её в качестве отрицательного контроля.
Используйте среду без добавок. Добавьте по 500 µL среды с добавками в каждую лунку и инкубируйте при 37 °C от 6 до 12 дней. В течение этого периода инкубации исследуйте планшет под микроскопом, чтобы обнаружить сосуды, прорастающие из аорты, а также развитые зрелые сосуды, которые определяются по дальнейшему ветвлению.
Следует трехмерно сфотографировать кольца из кольцевой ткани в период с шестого по двенадцатый день с помощью стандартного стереомикроскопа с фазовым контрастом. Кроме того, необходимо собирать супернатанты в разные дни в период с шестого по двенадцатый день и хранить их при температуре 4 °C для использования в течение суток или при -20 °C или -80 °C для последующего использования. Супернатанты можно анализировать различными методами, такими как ELISA для определения vgf или GREASE-анализ для определения уровней оксида азота.
Данные изображения были получены через 12 дней после размещения колец в лунках и инкубации либо с культурой, либо со средой (верхний ряд изображений), либо с ECGS, который использовался в качестве положительного контроля для визуализации прорастания сосудов (нижняя панель). Каждое изображение представляет собой репрезентативный снимок четырех из 12 колец, которые обычно используются в данном анализе для каждого условия.
Угол каждого аортального кольца в каждой отдельной лунке окрашен в черный цвет. При таком способе фотографирования аортальные кольца, подвергшиеся воздействию ECGS, демонстрируют рост сосудов; стрелками указаны некоторые из множества сформировавшихся сосудов. Каждый сосуд характеризуется цепочками эндотелиальных клеток с отдельными разветвлениями, что свидетельствует об их зрелости.
В культуре не наблюдается прорастающих сосудов. Лунки со средой на верхней панели. Мы только что продемонстрировали способ проведения анализа аорты при выполнении данной процедуры. Важно помнить о необходимости точного соблюдения условий проведения эксперимента.
На этом всё. Спасибо за просмотр и удачи в ваших экспериментах.
Просмотрите полный транскрипт и получите доступ к тысячам научных видео
Обзор
В данной статье представлен метод анализа кольца аорты, разработанный для изучения ангиогенеза путем стимуляции прорастания кровеносных сосудов из аорты мыши в контролируемой среде. Этот анализ позволяет напрямую добавлять ангиогенные соединения для оценки их влияния на рост новых сосудов в течение нескольких дней.
Основные компоненты исследования
Область науки
- Ангиогенез
- Биология сосудов
- Экспериментальные методы анализа
Теоретические сведения
- Ангиогенез имеет решающее значение как для физиологических, так и для патологических процессов.
- Метод анализа кольца аорты представляет собой модель для изучения формирования кровеносных сосудов.
- Понимание механизмов ангиогенеза может дать представление о различных заболеваниях.
- Данный анализ позволяет тестировать различные соединения в 3D-матрице.
Цель исследования
- Разработка гибкой системы для изучения ангиогенеза.
- Оценка воздействия потенциаторов и ингибиторов ангиогенеза.
- Наблюдение за прорастанием сосудов из колец аорты in vitro.
Используемые методы
- Препарирование грудной аорты мышей.
- Подготовка колец аорты и их помещение в 3D-матрицу.
- Инкубация колец аорты с экспериментальными реагентами.
- Наблюдение за ростом неососудов в течение 6–12 дней.
Основные результаты
- Успешное прорастание кровеносных сосудов из колец аорты.
- Оценка ангиогенного потенциала различных соединений.
- Демонстрация гибкости метода для различных экспериментальных условий.
- Понимание механизмов ангиогенеза.
Выводы
- Метод анализа аортального кольца является ценным инструментом для изучения ангиогенеза.
- Он позволяет проводить прямое тестирование ангиогенных факторов в контролируемой среде.
- Полученные результаты могут способствовать пониманию развития сосудов и связанных с этим заболеваний.
Часто задаваемые вопросы
Практическая значимость для промышленности
Метод анализа аортальных колец представляет собой физиологически релевантную органотипическую модель для оценки ангиогенных и антиангиогенных соединений на ранних этапах разработки. Обеспечивая возможность прямого тестирования соединений в 3D-матриксе с количественным определением роста неососудов, данный метод позволяет снизить риски при изучении механизмов воздействия на сосудистые мишени и валидировать соответствующие сигнальные пути. Этот анализ служит связующим звеном между скринингом эндотелия in vitro и моделями in vivo, повышая прогностическую достоверность при поиске ведущих соединений для программ по сердечно-сосудистым заболеваниям, онкологии и ишемическим патологиям.
Стратегическое применение в биофармацевтических исследованиях и разработках
Ранние этапы поиска и валидация мишени
- Научная ценность: проверка терапевтических гипотез путем оценки влияния соединений на прорастание из интактной ткани аорты.
- Практическая ценность: возможность функциональной валидации ангиогенных мишеней с использованием системы нативных эксплантатов сосудов.
- Прогностическая ценность: поддержка приоритизации портфеля препаратов путем выявления соединений с измеримым воздействием на формирование сосудов в контексте соответствующего заболевания.
Скрининг и разработка анализа
- Научная ценность: Подготовка валидированных биологических систем для скрининга зависимости «доза-ответ» модуляторов ангиогенеза.
- Практическая ценность: Стандартизация показателей с помощью фазово-контрастной микроскопии и сбора супернатанта для анализа биомаркеров.
- Ценность масштабируемости: Возможность проведения тестирования в 6 повторностях для каждого условия для учета биологической вариабельности и обеспечения надежности анализа.
Трансляционные и доклинические исследования
- Научная ценность: Обеспечивает релевантность модели заболеванию за счет использования аорты мыши, что отражает ангиогенные реакции, характерные для условий in vivo.
- Практическая ценность: Обеспечивает преемственность от этапа поиска до доклинической валидации, позволяя осуществлять лонгитюдный мониторинг роста новых сосудов.
- Снижение рисков: Помогает принимать решения о дальнейшем продвижении разработки путем выявления соединений со стабильной про- или антиангиогенной активностью в повторных опытах.
Интеграция конвейеров и рабочих процессов
Данный анализ вписывается в континуум поиска лекарственных средств — от валидации мишени до идентификации ведущих соединений, обеспечивая функциональный результат, который дополняет биохимические и клеточные тесты.
- Открывающая биология (Discovery Biology): обеспечивает проверку гипотез путем установления связи между воздействием соединений и фенотипическими изменениями в процессах спраутинга и созревания сосудов.
- Скрининг: обеспечивает готовность анализа за счет стандартизированного встраивания в BME и рандомизированного размещения колец для минимизации позиционного смещения.
- Аналитика: позволяет получать количественные данные с помощью анализа изображений длины/ветвления спраутов и измерения уровней ангиогенных факторов в супернатантах методом ELISA.
- Трансляционные исследования: связывают результаты с доклинической работой путем моделирования ангиогенных ответов в системе с учетом тканевого контекста.
- Корпоративное повторное использование: служит многократно используемой платформой для скрининга различных библиотек соединений в терапевтических областях, связанных с сосудистой патологией.
Операционное и корпоративное воздействие
- Научная ценность: Снижает механистическую неопределенность за счет наблюдения прямых эффектов на формирование неососудов в нативной ткани.
- Операционная ценность: Обеспечивает воспроизводимость благодаря стандартизированной подготовке кольца, созданию купола из BME и проведению повторных испытаний.
- Стратегическая ценность: Оптимизирует принятие решений о продолжении или прекращении разработки (go/no-go) путем ранней фенотипической валидации сосудистой активности.
- Влияние на портфель: Позволяет осуществлять приоритизацию соединений с учетом рисков на основе ангиогенной эффективности и специфичности.
Рекомендации по внедрению
- Требуется опыт проведения диссекции мышей и работы с тканями в стерильных условиях.
- Результат зависит от стабильного качества BME и правильной гелации при 37°C для формирования купола.
- Необходимы стандартизированные протоколы визуализации и «слепой» анализ для минимизации вариабельности результатов, зависящей от оператора.
- Требуется оптимизация дозировки соединений и времени инкубации с учетом их растворимости и стабильности в водной среде.
- Метод ограничен биологической вариабельностью между сегментами аорты, что обуславливает необходимость проведения повторных испытаний для обеспечения статистической достоверности.
