Режиссер Сотовая самосборки для изготовления Cell-Производные Кольца тканей для биомеханического анализа и тканевая инженерия

Общая цель данной процедуры заключается в создании трехмерных тканевых конструктов из агрегированных клеток и матрикса, производного от клеток, которые могут быть использованы для функционального анализа. Это достигается путем первоначального фрезерования поликарбонатной формы для создания кольцевых лунок с круглым дном. Затем на поликарбонатную форму наливают полидиметилсилоксан (PDMS) для создания шаблона.

Затем шаблон из PDMS используется для формирования лунок aros. Заключительным этапом является посев клеток в лунки aros, чтобы обеспечить их агрегацию и формирование сплошных тканевых колец. В конечном итоге данный метод может быть использован для достижения клеточной самосборки и тканевой инженерии с использованием различных типов клеток, а также позволяет анализировать вклад клеток и производного от них внеклеточного матрикса в структуру и функцию ткани.

Основным преимуществом данного метода по сравнению с другими подходами в тканевой инженерии является возможность создавать тканевые конструкции полностью из клеток и вырабатываемого ими внеклеточного матрикса быстрее, чем сообщалось ранее, и в формате, подходящем для механического анализа. Начните с фрезерования поликарбонатной пластины толщиной в полдюйма для создания 15 кольцевых лунок с круглым дном и диаметром центрального стержня 2 мм. Очистите поликарбонатную форму, чтобы удалить пластиковую стружку, образовавшуюся в процессе фрезерования, и дайте форме высохнуть. Затем смешайте PDMS в соотношении основы к отвердителю 10:1. Дегазируйте раствор для удаления всех пузырьков воздуха, после чего залейте его в поликарбонатную форму.

Затем снова удалите пузырьки воздуха из смеси в форме путем дегазации и отверждайте PDMS в печи при 60 °C в течение четырех часов; пока PDMS отверждается, растворите 2% AROS в DMEM. После отверждения осторожно снимите шаблон из PDMS, медленно отделяя его от поликарбоната, затем промойте PDMS мыльным раствором и подвергните автоклавированию вместе с раствором DMEM AROS. Теперь поместите автоклавированный шаблон из PDMS на ровную поверхность и заполните его расплавленным AROS, сначала внося AROS пипеткой в каждую форму центральных стоек, а затем заполняя пространство вокруг них.

Дайте аросам затвердеть в течение примерно 15 минут. Затем переверните форму, чтобы извлечь аросы из PDMS. Срежьте излишки арос вокруг каждой лунки, после чего поместите одну лунку с аросом в каждую лунку 12-луночного планшета.

Добавьте питательную среду для культур клеток вокруг лунки aros, не заполняя саму лунку доверху. Затем поместите планшеты в инкубатор для уравновешивания температуры, пока осуществляется подготовка клеток. При достижении 90% конфлюэнтности трипсинизируйте гладкомышечные клетки аорты крысы и ресуспендируйте их.

Подвесьте клетки в концентрации 5 × 10⁶ клеток на мл. Затем перенесите пипеткой по 100 µL ресуспендированной клеточной суспензии в каждую из уравновешенных лунок AROS. При нанесении клеток в каждую лунку используйте круговые движения.

Поместите планшеты в инкубатор на 24 часа, не тревожа их. Заменяйте среду каждые два дня, аспирируя ее из области вокруг лунки, а затем заполняя каждую лунку до полного погружения формы aros. По завершении культивирования наполните небольшую чашку Петри раствором PBS.

Извлеките каждое кольцо из формы aros, сдвинув его по центральному стержню. Поместите кольца в чашки Петри с PBS Center, расположив кольцо под системой цифровой визуализации. Используйте программное обеспечение для детектирования границ, чтобы измерить толщину кольца в четырех точках по окружности: сверху, снизу, слева и справа.

Для проведения испытания на одноосное растяжение закрепите кольцеобразный образец в двух зажимах с тонкими проволоками. Растягивайте зажимы до тех пор, пока к кольцу не будет приложено разрывное усилие в 5 mN.

Затем введите значение площади поперечного сечения, рассчитанное на основе измерений толщины, и запишите рабочую длину образца. Проведите предварительное циклическое нагружение кольца восемь раз в диапазоне от нагрузки разрыва до 50 kilo pascal. Приложите напряжение со скоростью 10 millimeters per minute; после восьмого предварительного цикла растяните образец до разрыва со скоростью 10 millimeters per minute.

Для каждого кольца измерьте предел прочности при растяжении и относительную деформацию при разрыве, а затем на основе полученных данных рассчитайте максимальный модуль касательной. Помимо функциональных исследований in vitro, данные кольца из живых клеток также могут срастаться, образуя тканевые трубки. Используйте хирургические ножницы, чтобы обрезать концы силиконовых трубок под углом для создания скошенных краев, после чего подвергните силиконовые трубки автоклавированию.

Наполните чашку Петри средой, перенесите стерилизованные специальные силиконовые держатели для трубок в бокс биологической безопасности и поместите их в пустую чашку Петри. Затем извлеките кольца из лунок aros и поместите их в чашку Петри с наполнителем. Поместите силиконовые трубки в ту же чашку Петри для увлажнения перед использованием.

С помощью пинцета поместите кончик силиконовой трубки в центр кольца и осторожно наденьте кольцо на трубку. Совместите кольца так, чтобы они соприкасались, аккуратно сдвигая их поочередно в обоих направлениях вдоль трубки. После установки колец расположите силиконовые трубки в поликарбонатных держателях и закрутите две части держателя друг с другом.

Добавьте 55 milliliters среды в чашку Петри. Заменяйте среду каждые три дня на протяжении всего периода культивирования для удаления тканевых трубок. Сначала наполните чашку Петри PBS.

Затем извлеките силиконовые трубки из поликарбонатного держателя и с помощью пинцета сдвиньте трубки с тканью с силиконовых трубок в чашку. При правильном выполнении клетки оседают на дно лунок aros и сокращаются в течение 24 часов после размещения, образуя тканевое кольцо вокруг центрального стержня в лунке Agarro s; на данном графике представлен пример кривой «напряжение — деформация», полученной в результате одноосного испытания на растяжение тканевого кольца толщиной 2 мм, выращенного из гладкомышечных клеток крысы. Значения предела прочности при растяжении, максимального модуля упругости и деформации при разрыве затем используются для сравнения механических свойств образцов тканевых колец, выращенных при различных параметрах культивирования.

Механические свойства тканевых колец можно регулировать, изменяя параметры культивирования, включая количество высаженных клеток, продолжительность культивирования, среду для культивирования и используемый тип клеток. Помимо гладкомышечных клеток крысы, первичные гладкомышечные клетки человека также формируют тканевые кольца с аналогичным пределом прочности на разрыв.

Мезенхимальные стволовые клетки человека также агрегируют с образованием колец, однако они оказались недостаточно прочными для механических испытаний. Наша система позволяет создавать инженерные тканевые конструкции полностью из клеток, просто посевая их в наши специально разработанные лунки aros. После изготовления первичной поликарбонатной формы можно создать неограниченное количество шаблонов из PDMS, которые затем используются для изготовления форм, поэтому дополнительное оборудование не требуется.

Данная система универсальна: мы использовали в ней несколько различных типов клеток для создания тканевых колец, поэтому эта система может быть потенциально применена как в задачах тканевой инженерии, так и в исследованиях in vitro для изучения вклада клеток и внеклеточного матрикса в структуру и функцию тканей.