Быстрое высокой пропускной метод картирования рибонуклеопротеиды (мяРНП) по правам пре-мРНК

Для картирования сайтов связывания рибонуклеиновых белков на пре-мРНК начните с покрытия заданной области интересующей пре-мРНК NNA окнами по 30 нуклеотидов и синтезируйте эти перекрывающиеся олигонуклеотиды в виде массива. Олигонуклеотиды отделяют от массива путем кипячения и совместно осаждают с интересующим РНП. Общий исходный пул маркируют SCI 3, а пул связавшихся молекул — SCI 5, после чего оба образца наносят на детектирующий массив.

Затем проводится сканирование массива, и для интерпретации результатов используется программное обеспечение для извлечения признаков. Соли. Здравствуйте, я Кейт Уоткинс из лаборатории Уилла Фэрбразера на кафедре молекулярной и клеточной биологии (MCB) Университета Брауна. Сегодня я продемонстрирую вам быстрый и недорогой метод определения точного местоположения РНК-белкового комплекса на pre-mRNA в лаборатории, синтезируя pre-mRNA в виде пула перекрывающихся олигонуклеотидов.

Затем этот пул можно разделить на связанную и несвязанную фракции с помощью коиммунопреципитации и проанализировать с помощью микрочипа. Хотя эта процедура имеет множество применений, мы используем ее для изучения нескольких факторов сплайсинга и их роли в альтернативном сплайсинге. Итак, приступим.

Для начала данной процедуры используйте браузер генома uc SC, чтобы загрузить определенные гены, сайты сплайсинга или другие интересующие области, на основе которых будет разработан пул prem A. Выберите интересующие окна, затем выполните компьютерное покрытие этих областей с длиной прочтения 30 нуклеотидов и перекрытием в 20 нуклеотидов, так чтобы каждый олигонуклеотид был сдвинут на 10 нуклеотидов относительно предыдущего. После определения олигонуклеотидов длиной 30 нуклеотидов фланкируйте каждый из них универсальными последовательностями праймеров.

Отправьте олигонуклеотиды в компанию Agilent для синтеза на заказном олигонуклеотидном микрочипе. После получения микрочипа начните извлечение олигонуклеотидов ДНК с его поверхности, поместив покровное стекло чипа в камеру для гибридизации и осторожно пипетируя 500 µL деионизированной воды на стекло. Положите стекло микрочипа лицевой стороной вниз на покровное стекло так, чтобы метки на каждом стекле были обращены друг к другу, стараясь избегать образования пузырьков воздуха, которые могут нарушить процесс извлечения олигонуклеотидов.

Закройте камеру гибридизации и инкубируйте ее в печи для гибридизации в течение ночи при 99 °C с вращением. На следующий день осторожно извлеките массив из камеры и слейте воду, содержащую олигонуклеотиды, высвобожденные с поверхности массива. Перенесите смесь высвобожденных олигонуклеотидов в пробирку типа «эппендорф» объемом 1,5 мл и подвергните воздействию ультразвука для разрушения возможных агрегатов с амплитудой 50%, трижды используя импульсы продолжительностью от трех до пяти секунд. Затем амплифицируйте полученную смесь с помощью ПЦР с малым числом циклов, используя универсальные праймеры с присоединенным к их концу T-промотором.

Количество необходимых циклов может варьироваться в зависимости от эффективности восстановления олигонуклеотидов. Избегайте избыточной амплификации, которая проявляется в виде размытой полосы на акриламидном геле. В завершение используйте набор MegaShort Script от компании Amon для транскрипции РНК.

Остановите реакцию транскрипции путем экстракции РНК фенол-хлороформным методом с последующим осаждением этанолом с использованием ацетата натрия и glyco blue в качестве носителя. Ресуспендируйте осадок РНК в 105 µL ТЕ-буфера. Для точного определения концентрации РНК.

Используйте RiboGreen для построения стандартной кривой. Затем выполните измерение с помощью флуоресцентного планшетного ридера. Теперь пул РНК готов к проведению ко-иммунопреципитации для начала осаждения.

Сначала подготовьте магнитные бусины, смешав DynaBeads с протеином A и протеином G в соотношении один к одному до конечного объема 50 µL на одну реакцию. Соберите бусины в одном месте с помощью магнитной подставки для разделения, чтобы удалить супернатант. Затем дважды промойте их равным объемом холодного 1x PBS; после второго промывания перейдите к следующему этапу.

Привзвесьте гранулы в равном объеме холодного 1X PBS и добавьте 2 ng антител на порцию. Это количество может варьироваться в зависимости от антител, поэтому может потребоваться проведение экспериментов для определения оптимальных условий связывания антител с гранулами. Инкубируйте смесь в течение ночи при 4 °C на ротаторе.

Утром добавьте 2 µg суммарной РНК дрожжей, подвергнутой соникации, на одну реакцию для блокирования неспецифического связывания и инкубируйте при перемешивании еще 30 минут при 4 °C. По завершении этапа блокирования снова используйте магнитный сепаратор для удаления супернатанта. Затем дважды промойте гранулы холодным 1× PBS; после второй промывки оставьте PBS в пробирке и перенесите аликвоты по 50 µL смеси гранул в новые пробирки.

Одна пробирка для каждой реакции ко-ИП. Теперь бусины готовы к ко-ИП. Далее приготовьте мастер-микс, смешав пул РНК-олигонуклеотидов с ядерным экстрактом клеток.

В качестве источника РНП возьмите аликвоту мастер-микса объемом 50 µL в качестве общего образца. Для защиты праймеров можно добавить праймеры-протекторы, которые представляют собой РНК-версии универсальных праймеров; это предотвращает связывание белка с последовательностью праймера или возникновение вторичной структуры РНК. Чтобы начать коиммунопреципитацию, удалите супернатант из аликвот с бусинами и ресуспендируйте бусины в 120 µL оставшегося мастер-микса. Перемешивайте реакционные смеси на качалке при температуре 4 °C в течение одного-двух часов.

По окончании инкубации из каждой пробирки можно удалить небольшой объем жидкости вместе с бусинами. Для дополнительной проверки эффективности или специфичности связывания поместите оставшиеся реакционные смеси на магнит и удалите супернатант. Затем проведите один или два этапа промывки холодным 1X PBS.

РНК, связанная с антителом на гранулах посредством РНП, представляет собой образец иммунопреципитации (ИП). Ресуспендируйте гранулы ИП в 50 µL 1% SDS в 0,1 XTE буфере и нагрейте образцы при 65 °C в течение 15 минут. Чтобы элюировать РНК, удалите супернатант, который теперь содержит РНК, ранее связанную с гранулами; очистите его с помощью экстракции фенол-хлороформом с последующим осаждением этанолом, затем ресуспендируйте осадок в 50 µL 0,1 XT буфера.

Затем проведите обратную транскрипцию образцов с использованием универсальных обратных праймеров. После этого амплифицируйте образцы методом ПЦР с помощью универсальных праймеров, один из которых должен содержать T7-промотор. Количество циклов, необходимых для амплификации пула, будет зависеть от эффективности ко-иммунопреципитации.

Используя набор для синтеза мега-шортов (mega shorts) от Ambion, повторно проведите транскрипцию образцов, но на этот раз добавьте 2 µL amino allele UTP вместо T7 UTP, входящего в состав набора. Amino allele UTP будет использован в дальнейшем для маркировки РНК с помощью side eyes. По завершении транскрипции.

Образцы осаждают с помощью экстракции фенилхлороформом и этанола. Не используйте glyco blue или ацетат аммония, так как они могут помешать гибридизации образцов с микрочипом. Ресуспендируйте осадок в 4,5 µL 0,1 M карбоната натрия.

Для начала маркировки образцов добавьте 2,5 µL нуклеазно-свободной воды в общий образец. Добавьте 3 µL S3, а в образец IP — 3 µL SCI five. Инкубируйте в темноте в течение одного часа.

При комнатной температуре остановите реакцию, добавив в каждый образец 6 µL 4 M гидроксиламина HCL, тщательно перемешайте и центрифугируйте. Кратковременно инкубируйте в течение 15 минут при комнатной температуре, затем очистите меченные образцы с помощью экстракции фенилхлороформом с последующим осаждением этанолом. Большая часть красителя переходит в органическую фазу вместе со свободными нуклеотидами, поэтому осадки могут не иметь видимого окраса.

Ресуспендируйте каждый осадок в 50 µL 0.1 XTE. Следуйте инструкциям комплекта для гибридизации микрочипов Agilent по подготовке образца для микрочипа с одним исключением. Не фрагментируйте РНК. Сразу после добавления буфера для фрагментации добавьте гибридизационный буфер, чтобы остановить процесс фрагментации.

Поместите образцы на микрочип и проведите гибридизацию при 50 °C в течение трех часов при вращении микрочипа. В конических пробирках объемом 50 мл приготовьте следующие растворы объемом 50 мл: одну пробирку с 2X буфером SC, две пробирки с 1X буфером SC и одну пробирку с деионизированной водой.

После трехчасовой инкубации осторожно разжмите зажимы сэндвич-слайда с массивом и поместите его в буфер 2 XSSC. С помощью пинцета аккуратно отделите массив от покровного стекла.

Осторожно снимите покровное стекло, стараясь не касаться матрицы. После извлечения стекла закройте коническую пробирку и аккуратно переворачивайте ее в течение 60 секунд. С помощью пинцета перенесите матрицу в раствор 1X SSC.

Закройте пробирку крышкой и осторожно переворачивайте ее в течение одной минуты. Затем перенесите матрицу во второй раствор XSSC и снова осторожно переворачивайте в течение одной минуты. В завершение перенесите матрицу в пробирку с деионизированной водой и осторожно переворачивайте в течение 30 секунд.

Высушите массив, приложив края предметного стекла к салфетке Kimwipe. Продолжайте вращать массив на салфетке, стараясь не повредить сторону с олигонуклеотидами. Поместите массив в пустую коническую пробирку и переходите к сканированию массива.

Переходите к сканированию микрочипа. Перед вами пример массива. Каждый признак или олигонуклеотид окрашен либо в зеленый цвет для общего необогащенного пула, либо в красный — для пула, обогащенного путем иммунопреципитации (IP).

Сигнал для каждого признака нормируется по общей интенсивности в данном канале. Конечным результатом является логарифмическое отношение интенсивности красного канала к зеленому. Для каждого признака на массиве средний балл в каждой геномной координате сопоставляется с соответствующим местоположением.

Иллюстрация этого этапа усреднения представлена для трех перекрывающихся олигонуклеотидов длиной 30 нуклеотидов с показателями два, четыре и 0,5, где показан средний показатель обогащения для каждого окна в 10 нуклеотидов. Здесь приведен пример схемы связывания полипиримидинового связывающего белка PTB в гене CLTA; особенности гена указаны в нижней части, а логарифмы средних показателей обогащения для участков, связанных с PTP, представлены темно-красными вертикальными полосами. Светло-красные полосы обозначают области, не обогащенные связыванием PTP.

Я только что продемонстрировал вам, как быстро и эффективно создать пул олигонуклеотидов, который перекрывает интересующие области, такие как альтернативно сплайсированные аксоны. Мы анализируем наши пулы с помощью микрочипов, но также возможно их секвенирование с использованием технологий Illumina, Lexi sequencing или традиционного секвенирования по Сенгеру. При выполнении этой процедуры важно помнить, что создание пула допускает модификацию как на уровне РНК, так и на уровне белка.

На уровне РНК в олигонуклеотидную последовательность можно ввести аутологичные области, болезнетворные мутации, полиморфизмы или случайные мутации. На белковом уровне фактор связывания РНК может быть модифицирован путем фосфорилирования или других посттрансляционных модификаций. Кроме того, можно манипулировать условиями связывания, чтобы повысить или понизить уровни дополнительных факторов, которые либо конкурируют с интересующим белком связывания РНК, либо взаимодействуют с ним.

На этом всё. Спасибо за просмотр и удачи в ваших экспериментах.