Метод выделения и идентификации мРНК, микроРНК и белковых компонентов рибонуклеопротеидных комплексы из клеточных экстрактов использованием RIP-Chip

Целью данного видео является демонстрация метода выделения и идентификации РНК и белковых компонентов рибонуклеопротеиновых комплексов из клеточных экстрактов с использованием методов иммунопреципитации. Здравствуйте, меня зовут Гаррет Дом, я аспирант кафедры молекулярной микробиологии и иммунологии Университета Миссури, работаю под руководством доктора Элиссо. Благодаря развитию высокопроизводительного секвенирования и эффективного анализа на микрочипах, глобальный анализ экспрессии генов стал простым и доступным способом сбора данных во многих исследовательских моделях и моделях заболеваний.

Однако стационарные уровни мРНК целевого гена не всегда напрямую коррелируют со стационарными уровнями белка. Вероятным объяснением этого расхождения является посттранскрипционная регуляция генов, обусловленная взаимодействием РНК-связывающих белков.

Посттранскрипционная регуляция влияет на локализацию, стабильность и трансляцию мРНК путем формирования рибонуклеопротеинового комплекса с целевыми мРНК. Идентификация этих неизвестных новых мишеней мРНК из клеточных экстрактов в составе данного комплекса имеет решающее значение для понимания механизмов и функций РНК-связывающих белков и их последующего влияния на выход белка. В данном протоколе описывается метод, называемый иммунопреципитацией рибонуклеопротеинов (RIP), который позволяет идентифицировать специфические мРНК, ассоциированные с рибонуклеопротеиновым комплексом.

Перед началом эксперимента крайне важно подготовить все реагенты, контейнеры и принадлежности. Обработайте стеклянную посуду ингибитором РНКаз, таким как RNA ZAP от Ambion, после чего промойте её водой, обработанной DPCI; убедитесь, что все реагенты подтверждены как свободные от РНКаз. Первым этапом процедуры является выделение рибонуклеопротеинового комплекса из клеточного лизата: соберите клетки тканей, находящиеся в фазе экспоненциального роста, чтобы получить от 2 до 5 мг общего белка для каждого используемого образца; обычно достаточно двух культуральных чашек P 150.

В данной работе мы осуществляем сбор линий клеток рака молочной железы человека MB 2 31 и MC семь, а также исследуем рибонуклеиновые взаимодействия РНК-связывающего белка. Важно отметить, что для каждого исследуемого РНК-связывающего белка необходимо оптимизировать общее количество клеток и белков для максимизации соответствующих взаимодействий между целевой mRNA и РНК-связывающим белком. Осадите клетки путем центрифугирования при 1000 RPM в течение примерно 8–10 минут при 4 °C, затем трижды промойте ледяным PBS. После окончательной промывки осторожно постучите по дну пробирки и ресуспендируйте клеточный осадок в равных объемах подготовленного лизирующего буфера для полисом, содержащего ингибиторы РНКаз и протеаз.

Рекомендуется аккуратно отмерить точный объем осадка клеток, осторожно перемешать смесь с помощью пипетки для разрушения клеточных агрегатов и инкубировать лизат на льду в течение пяти минут. Центрифугируйте при 13, 000 G в течение 20 минут при температуре четыре градуса Цельсия, чтобы очистить лизат от клеточного дебриса; немедленно перенесите очищенный супернатант в предварительно охлажденные микроцентрифужные пробирки для РНК, держите их на льду и храните при температуре минус 80 градусов Цельсия.

Данный лизат можно хранить до шести месяцев при температуре -80 °C. Избегайте повторных циклов замораживания-оттаивания, так как это может привести к деградации белков и/или мРНК. Рекомендуется проводить иммунопреципитацию (IP) незамедлительно.

Выполните быстрый количественный анализ концентрации белка в лизате, используя стандартный метод Брэдфорд. Далее необходимо подготовить материалы для выделения интересующего нас специфического белка. Сначала проведите предварительное набухание белка.

Сферические бусины выдерживают в течение ночи в буфере N NT two с добавлением 5% BSA при температуре 4 °C. Используйте буфер NT two в соотношении 4:1 с бусинами PAS. Возможно длительное хранение в течение нескольких месяцев при температуре 4 °C.

При добавлении 0,1% sodium azi перед использованием удалите избыток буфера NT two таким образом, чтобы итоговое соотношение гранул к буферу составляло один к одному. Используя РНКаз-свободные микроцентрифужные пробирки объемом 1,5 мл, отберите 100 µL суспензии SRO speed и добавьте 30 µg антител для каждой отдельной реакции IP. Например, в нашем эксперименте мы используем антитела к who are, которые представляют собой антитела mouse IgG1.

Следовательно, в качестве контрольного антитела мы также используем IgG. Затем добавьте от 100 до 200 µL буфера NT 2 к смеси антител и магнитных частиц. Кроме того, параллельно следует использовать антитело соответствующего изотипа или цельную нормальную сыворотку того же вида в качестве антитело-контроля для учета фоновой РНК.

Добавьте соответствующее антитело в смесь микросфер и инкубируйте в течение ночи в режиме вращения (tumbling) при температуре 4 °C. Подготовьте микросферы, покрытые антителами, непосредственно перед использованием, промыв их 1 мл ледяного буфера NT 2 пять раз; промывайте микросферы путем центрифугирования при 13 000 G в течение 1–2 минут при температуре 4 °C. Осторожно удалите супернатант с помощью ручного дозатора или аспиратора.

Данная промывка способствует удалению несвязавшихся антител, а также загрязнений РНК из смеси антител. После завершения финальной промывки ресуспендируйте гранулы в 700 µL ледяного буфера NT2, затем обработайте их различными ингибиторами РНКаз для защиты целевых мРНК, включая 10 µL РНКаза-ингибитора, 10 µL 100 мМ DTT и 15 µL EDTA. Доведите объем до 900 µL с помощью буфера NT2.

Далее мы проведем иммунопреципитацию целевого комплекса. Для снижения фонового сигнала при последующем анализе РНК после процедуры RIP мы настоятельно рекомендуем выполнить этап предварительной очистки: проведите преклиринг с использованием 15 micrograms изотипического контроля в течение 30 минут при температуре four degrees Celsius. Добавьте 50 microliters предварительно набухших PAS-бисеров, не покрытых антителами.

Инкубируйте в течение 30 минут при 4 °C с перемешиванием, затем центрифугируйте при 10,000 G и 4 °C. Осадите образец. Сохраните супернатант для ip.

Затем добавьте 100 µL выделенного осветленного лизата, содержащего примерно от двух до пяти мг белка, в подготовленную смесь антител. Разбавление лизата поможет снизить уровень фонового сигнала; плотно закройте пробирку крышкой и инкубируйте при 4 °C в течение четырех часов в режиме перемешивания. Затем осадите гранулы центрифугированием при 5 000 G в течение пяти минут при 4 °C и сохраните супернатант для возможного последующего анализа, заморозив его при -80 °C, как было описано ранее. Промойте гранулы пять раз, используя по 1 мл ледяного буфера TNT, с последующим центрифугированием.

Затем удалите супернатант с помощью ручной пипетки или аспиратора. Для снижения фонового сигнала могут быть использованы более жесткие методы, такие как добавление дезоксихолата натрия, мочевины или SDS в буфер NT2. По возможности держите образцы на льду и работайте быстро, чтобы минимизировать деградацию целевой мРНК.

В завершение мы будем использовать обработку ДНКазой и протеиназой K с последующим осаждением РНК для выделения РНК рибонуклеопротеинов; после промывки ресуспендируйте гранулы в 100 µL буфера N NT two, дополненного 5 µL безРНК ДНКазы one. Выдержите образцы при 37 °C в течение 5–10 минут. Добавьте 1 mL буфера N NT two и центрифугируйте при 5,000 ×g в течение пяти минут.

Удалите супернатант после центрифугирования. Ресуспендируйте осадок SROs в 100 µL буфера NT 2, содержащего 5 µL протеиназы K в концентрации 10 mg/mL и 1 µL 10% SDS. Инкубируйте смесь ресуспендированных гранул в течение 30 минут на водяной бане при температуре 55 °C, осторожно встряхивая пробирку каждые 10 минут. Протеиназа K способствует высвобождению рибонуклеопротеиновых компонентов. Центрифугируйте для осаждения гранул.

Центрифугируйте при 5 000 G в течение пяти минут при комнатной температуре, затем соберите супернатант, объем которого должен составлять примерно 100 µL. Далее к гранулам добавьте 200 µL буфера NT 2 и центрифугируйте при 5 000 G в течение двух минут. Соберите примерно 200 µL супернатанта, а гранулы удалите.

Объедините супернатанты, добавьте 300 µL кислого фенола нижнего слоя и перемешайте на вортексе. Выдержите одну минуту при комнатной температуре и центрифугируйте на максимальной скорости при комнатной температуре в течение одной минуты. Соберите 250 µL верхнего слоя.

Будьте очень осторожны, чтобы не нарушить интерфейс, так как это приведет к загрязнению. К образцу РНК добавьте 25 µL ацетата натрия при pH 5.2, 625 µL охлажденного 100% этанола и 5 µL смеси Glyco Blue. Тщательно перемешайте и храните в течение ночи при температуре -20 °C.

Дополнительно, для обеспечения надлежащего восстановления РНК, добавление glyco blue повысит видимость осадка РНК, так как этот реагент выступает в роли молекулы-носителя. На следующий день перемешайте содержимое пробирок, перевернув их от трех до пяти раз, затем центрифугируйте при 12 000 G при температуре 4 °C в течение 30 минут и удалите супернатант. Добавьте 1 мл охлажденного 70% этанола к синему осадку и перемешайте путем инверсии или вортексирования, после чего центрифугируйте.

Центрифугируйте образец при 12 000 G в течение двух минут при температуре четыре градуса Цельсия. Удалите супернатант и снова центрифугируйте при 12 000 G в течение одной минуты при температуре четыре градуса Цельсия. Удалите остатки 70% этанола с помощью пипетки и высушите осадок на воздухе.

Выдержите при комнатной температуре в течение пяти минут. Ресуспендируйте в 20–40 µL воды, свободной от РНК и ДНК. Теперь образец готов к количественному определению с помощью спектрометрии NanoDrop и дальнейшему использованию, такому как количественная ПЦР в реальном времени или микроматричный анализ. После выделения РНК были проведены микроматричный анализ и количественная ПЦР в реальном времени, чтобы выявить мРНК-мишени РНК-связывающего белка и степень их обогащения в результате иммунопреципитации.

Подтверждение с помощью вестерн-блоттинга демонстрирует чистую изоляцию белка. Количественная ПЦР показывает кратность обогащения целевой мРНК бета-актина по сравнению с контролем IgG. Хотя анализ микрочипов выявил уникальные генетические профили линий клеток рака молочной железы MC 7 и MB 2 31, иммунопреципитация рибонуклеопротеинов была установлена нашей группой, а также многими другими исследовательскими группами, в качестве отличного инструмента для изоляции и изучения взаимодействий между РНК-связывающими белками и их мишенями мРНК; несмотря на высокую чувствительность метода и специфику его применения, правильное выполнение данной процедуры позволит выделить эти рибонуклеопротеиновые комплексы, которые до недавнего времени были недоступны для обнаружения и анализа.