Multi-Параметрический Островок Perifusion системы в микрожидкостных устройств Perifusion

В данной презентации мы представим микрофлюидную систему перфузии островков, предназначенную для одновременного измерения динамики секреции инсулина, притока ионов кальция и изменений митохондриального потенциала островков поджелудочной железы в ответ на воздействие секретогогов инсулина. Система перфузии состоит из трехслойного микрофлюидного устройства, шприцевых насосов и фракционного коллектора. Приток кальция и митохондриальный потенциал, индуцированные секретогогами инсулина, визуализируются с помощью установки с флуоресцентным микроскопом.

Здравствуйте, меня зовут Ола, я сотрудник лаборатории доктора Вала Холтера на кафедре трансплантационной хирургии Иллинойсского университета в Чикаго. Здравствуйте, я Дон Ли, также из лаборатории Холтера. Здравствуйте, я Триша Харт, также из лаборатории доктора Вала Холтера.

Сегодня мы продемонстрируем процедуру одновременной визуализации век с использованием линейного градиента глюкозы. Мы применяли эту процедуру в нашей лаборатории для изучения визуальных характеристик и функций век. Итак, приступим.

Микрофлюидное устройство, используемое в данной процедуре, собрано из трех слоев отвержденного ПДМС, изготовленных методом стандартной фотолитографии. Первый слой, полученный по силиконовой форме, содержит лунки микрофлюидного устройства глубиной 150 micrometers и диаметром 500 micrometers, предназначенные для надежной фиксации колец.

Средняя часть канала расширена для распределения потока с целью улучшения обмена раствором. Внутри устройства в центре слоя путем пробивания отверстия высотой 3 mm и шириной 7 mm создается обменная лунка. Третий слой представляет собой толстую пластину из PDMS. Для подготовки этого слоя пробейте небольшие отверстия с обеих сторон, которые совпадают по расположению с входом и выходом канала.

После создания всех трех слоев первый слой прикрепляют к стеклянному предметному стеклу лунками вверх. Затем второй слой прикрепляют к первому слою так, чтобы расстояние между каналами было направлено вверх. Наконец, третий слой прикрепляют ко второму слою.

После склеивания слоев устройство готово к использованию в экспериментах. Используя шприц объемом 10 milliliter, заполненный 70% ethanol и подключенный к входному порту устройства с помощью трубки Tai, стерилизуйте микрофлюидное устройство, пропуская ethanol через каналы устройства. Затем, используя ту же установку, пропустите деионизированную воду, чтобы вымыть ethanol.

После стерилизации устройства поместите его на подогреваемую платформу микроскопа с помощью трубок Tigon, подключите шприцевые насосы с растворами глюкозы высокой и низкой концентрации к Y-образному соединителю. Затем подключите их к входному отверстию микрофлюидного устройства. Выходное отверстие микрофлюидного устройства подключите к фракционному коллектору.

Убедитесь, что трубки расположены на плитке с подогревом при 37 °C. Очень важно поддерживать физиологическую температуру растворов на протяжении всего эксперимента. Затем с помощью программы LabVIEW запустите подачу градиента глюкозы, который будет перфузироваться через микрофлюидную сеть в ходе эксперимента.

Данное программное обеспечение изменяет скорость потока двух растворов глюкозы. Путем управления шприцевыми насосами здесь можно создавать различные профили градиента глюкозы: линейный, колоколообразный и прямоугольный. В данном эксперименте представлены значения в сравнении с рассчитанными ожидаемыми показателями; будет использоваться линейный градиент глюкозы от 2 mM до 25 mM с изменяющейся скоростью потока двух растворов глюкозы от 0.01 mL/min и постоянной скоростью потока 0.25 mL/min при поступлении в устройство после смешивания растворов.

После выбора подходящего профиля градиента проверьте его стабильность. Сначала запустите систему градиента. Затем запустите фракционную collecting-систему и соберите восемь фракций по 1 mL в пробирки типа Eppendorf.

Затем с помощью глюкометра измерьте концентрацию глюкозы в каждой пробирке, используя программу Excel. Проанализируйте результаты, полученные с глюкометра. Далее замените шприц с раствором высокой концентрации глюкозы на шприц, содержащий 0,5% BSA раствор в буфере Кребса-Рингера, и ПРОПУСТИТЕ 50 milliliters через устройство со скоростью 1 milliliter в минуту.

Это предотвратит неспецифическую абсорбцию инсулина стенками микроканала для обеспечения точности последующего измерения уровней секретируемого инсулина после перфузии BSA. Замените его раствором с высоким содержанием глюкозы reus. Суспендируйте 25–30 отобранных вручную островков мышиной поджелудочной железы в буфере Кребса-Рингера с 2 мM глюкозы, содержащем кальциевый индикатор fira 2:00 AM и индикатор митохондриального потенциала rumine 1 2 3, и инкубируйте в течение 30 минут при 37 °C.

После инкубации отсоедините устройство от системы перфузии и аккуратно поместите островки в микрофлюидное устройство: вставьте наконечник пипетки с островками во входной порт и медленно выдавите их. После загрузки снова подсоедините устройство к системе перфузии, соблюдая осторожность, чтобы не допустить попадания пузырьков воздуха. Затем запустите шприцевой насос, чтобы начать перфузию островков раствором KRB, содержащим 2 мМ глюкозы.

На этом этапе необходимо вымыть избыток красителя из среды, определить наборы возбуждающих и эмиссионных фильтров, а также время экспозиции, которые будут использоваться в ходе эксперимента. Затем настройте фракционный коллектор на сбор проб с интервалом в одну минуту, используя глазные яблочки с раствором с низким содержанием глюкозы. Используйте инструмент выделения области интереса (ROI) в программном обеспечении для PCI-визуализации, чтобы определить области или глазные яблочки, которые необходимо визуализировать.

Также обведите область фона, которая будет вычтена после 10-минутной промывки клеток, запустите сборщик фракций градиента глюкозы и начните запись таймлапс-изображений. Через 30 минут выключите программное обеспечение и шприцевой насос с высокой концентрацией глюкозы. Продолжайте перфузию с низкой концентрацией глюкозы, чтобы устранить эффект высокой концентрации глюкозы.

Через 10 минут остановите поток раствора с низким содержанием глюкозы, выключив шприцевой насос. После завершения перфузии экспортируйте данные в Excel для анализа. Количество инсулина, секретированного в перфузат, можно определить с помощью ELISA для островков Лангерганса мыши.

Проводили перфузию линейным градиентом глюкозы от 2 до 25 мМ, как показано здесь. Приток кальция и секреция инсулина запускаются примерно через 13 минут перфузии, что соответствует концентрации 6 мМ глюкозы. Изменения митохондриального потенциала, как и ожидалось, наблюдаются раньше, примерно через 11 минут.

Эти данные демонстрируют преимущество использования данной микрофлюидной сети для характеристики физиологии глазков. Мы только что показали вам, как использовать наше микрофлюидное устройство для перфузии при изучении физиологии глазков. При выполнении этой процедуры важно помнить о необходимости отсутствия пузырьков воздуха в устройстве, так как это может привести к смещению глазков во время эксперимента.

Кроме того, скорость потока можно увеличить до 1 мл в минуту, не смещая глазковые отверстия. На этом всё. Спасибо за просмотр и удачи в вашем эксперименте.