Мозг фрагмент Стимуляция Использование микрожидкостных сети и стандартные палаты перфузии

Основная цель проекта, который мы представим вам сегодня, заключается в обеспечении возможности пространственного и временного контроля стимуляции мозга. Еще одним важным аспектом является то, что благодаря простой модификации уже и без того сложной электрофизиологической установки мы можем распространить это микрофлюидное устройство среди различных лабораторий, которые фактически используют стимуляцию мозга. Здравствуйте, я Джава Чек Мохаммад из лаборатории Эдингтона на факультете биоинженерии Иллинойсского университета в Чикаго.

Сегодня я покажу вам, как использовать простое микроfabricated микрофлюидное устройство для стимуляции срезов мозга. Устройство для срезов мозга, которое мы продемонстрируем сегодня, очень полезно по нескольким причинам; главная из них заключается в его модульности, что позволяет интегрировать его в существующую электрофизиологическую установку без каких-либо дополнительных модификаций. Кроме того, оно позволяет избежать использования трубок и насосов, которые обычно усложняют любое микрофлюидное устройство.

Поскольку мы используем метод пассивной прокачки, нам не требуются трубки или насосы. Третий момент заключается в том, что это всего лишь тонкий лист мембраны из PDMS, который помещается между покровным стеклом и стандартной перфузионной камерой, используемой в стандартной установке для электрофизиологии. Процедура, которую я продемонстрирую сегодня, начинается с мастер-формы из SU-8, изготовленной с помощью стандартного процесса литографии SU-8.

Используемая нами сегодня мастер-форма представляет собой двухслойную структуру: один слой содержит топологию микроканалов, а другой — проект отверстий-переходов (via), расположенных над этими каналами, чтобы растворы, протекающие по каналам, могли выходить через эти отверстия. Мы изготавливаем такую мастер-форму на кремниевой пластине, после чего заливаем ее сверху силиконом или ПДМС, чтобы перенести структуры с пластины на ПДМС. Таким образом, мы сейчас зальем ПДМС поверх этого устройства.

Затем мы возьмем мембрану из PDMS, сформированную после отверждения и приклеенную к предметному стеклу. Теперь у нас есть микрофлюидное устройство. После этого мы модифицируем стандартную перфузионную камеру, нанеся тонкий слой PDMS на дно камеры.

После подготовки модифицированной перфузионной камеры мы возьмем изготовленное ранее микрофлюидное устройство и прикрепим его к камере. При изготовлении микрофлюидного устройства есть два критически важных момента. Во-первых, перед нанесением PDMS необходимо выключить нагревательную плитку, чтобы PDMS не застыл мгновенно при заливке на подложку.

Еще один критический момент заключается в том, что проставки, которые мы используем по четырем углам кремниевой пластины, должны иметь высоту меньше, чем самая высокая структура на этой пластине. Это необходимо для того, чтобы при процессе отверждения PDMS можно было получить отверстия VR. Сейчас мы находимся в модульной чистой комнате с мягкими стенами; перед нами мастер-матрица, изготовленная с помощью стандартного процесса литографии C eight.

Это двухслойный мастер-шаблон, первый уровень которого представляет собой структуру каналов с четырьмя входными и одним выходным отверстием. В средней области всех четырех каналов расположены переходы или отверстия, находящиеся над каналами. Это метки совмещения, которые были созданы в процессе изготовления.

Теперь я покажу вам, как я буду удалять его и проводить отверждение PDMS. Из-за эффекта краевого валика толщина на внешней периферии пластины больше, чем у самих устройств в центре. Поэтому мы удалим эти метки совмещения с помощью лезвия бритвы, а затем, чтобы обеспечить необходимый зазор, мы будем использовать проставки высотой 140 micron, которые мы разместим по четырем углам пластины.

Следовательно, необходимо убедиться, что лезвие бритвы не касается самих устройств. Теперь я удалю частицы SVA с помощью сжатого воздуха, и пластина будет готова к подготовке формы из PDMS. Но перед этим нам нужно установить проставки высотой 140 мкм.

Теперь я закреплю четыре полоски ленты по четырем углам пластины. Затем я убежусь, что лента плотно прилегает к поверхности пластины. Лента высотой 140 мкм была выбрана потому, что двухслойная мастер-форма с каналами и вентиляционными отверстиями имеет высоту 150 мкм.

Когда мы помещаем груз поверх PDMS во время его отверждения, нам необходимо убедиться, что лист PDMS получится плоским. Для этого мы используем четыре проставки одинаковой высоты по углам. Сейчас я покажу, как мы будем наносить PDMS и отверждать его для изготовления устройств.

Но прежде чем я перейду к этому, позвольте показать вам, как мы готовили раствор PDMS. Мы берем 10 частей основы и одну часть отвердителя, затем тщательно перемешиваем их. В процессе смешивания в растворе PDMS образуется множество пузырьков; чтобы удалить эти пузырьки, мы помещаем PDMS в эксикатор. После выдерживания PDMS в эксикаторе в течение 10 минут пузырьки исчезают.

Теперь PDMS готов к отверждению. Сейчас я покажу вам, как нанести PDMS на подложку и подвергнуть его отверждению для получения мембраны из PDMS. Я нанесу PDMS на подложку, а затем накрою его этой прозрачной пленкой.

Это поможет нам снять поддерживающую конструкцию устройства, отделить устройство от прозрачной пленки, после чего я помещу грузы поверх пленки. Мы используем грузы для того, чтобы добиться равномерной толщины PDMS. Другим критически важным моментом является формирование отверстий переходных отверстий.

Таким образом, во всех местах, где расположены вентиляционные отверстия, мы хотим избежать наличия PDMS, и грузы помогут нам этого добиться. Как видно здесь, heating plate выключен; это необходимо для того, чтобы PDMS не полимеризовался мгновенно, поэтому мы оставляем его выключенным. Кроме того, перед нанесением PDMS необходимо убедиться, что подложка ровная.

Теперь мы можем перенести подготовленный ранее PDMS. Убедитесь, что вы дозируете PDMS достаточно близко к подложке, чтобы не образовались пузырьки воздуха. Самым важным моментом здесь является то, как вы накладываете прозрачную пленку поверх PDMS.

Убедитесь, что при укладке листа не образуются пузырьки воздуха. Сейчас я помещу одну из стеклянных пластин, чтобы излишки PDMS вышли наружу. Я помещаю еще три стеклянные пластины, чтобы зафиксировать их относительно данной мастер-формы.

Для данных конкретных элементов мы обнаружили, что размещение этих четырех стеклянных пластин позволяет удалить излишки PDMS из пространства между прозрачным слоем и пластиной. Мы ждем одну-две минуты, после чего можно включать нагревательную плитку. Для разных мастер-шаблонов и различных дизайнов может потребоваться увеличить или уменьшить количество стеклянных пластин, чтобы добиться необходимых отверстий переходных каналов. Теперь нагревательную плитку можно включать; я установлю температуру 75 °C.

Когда температура достигнет 75 °C, установите таймер на один час для полимеризации PDMS. После того как PDMS полимеризовался в течение одного часа, выключите нагревательную плитку и дайте ей остыть до 50 °C. Это необходимо для того, чтобы SEA не треснул.

Сразу после этого мы переносим образец с температуры 75 градусов при комнатной температуре; теперь можно выключить прибор и подождать, пока температура не опустится до 50 градусов Цельсия. Теперь, когда температура нагревательного столика снизилась до 50 градусов Цельсия, можно снять грузы с прозрачной пленки. Теперь мы можем снять пластину с нагревательного столика, и она готова к разрезанию.

Теперь лист PDMS готов к отделению от мастер-формы C8; необходимо снять алюминиевую фольгу. Затем следует удалить прозрачный лист. Перед нами стандартная перфузионная камера.

Мы модифицировали устройство, чтобы обеспечить возможность его выравнивания. Это отверстия, входные и выходные порты микрофлюидного устройства. Таким образом, на мембране из PDMS расположены четыре входных порта и один выходной порт.

Они должны совпадать с четырьмя входными и одним выходным отверстиями перфузионной камеры. Теперь я сдвину перфузионную камеру и совмещу её с отверстиями в мембране из PDMS. Теперь, когда они совмещены, мембрану можно вырезать.

Теперь можно извлечь камеру с помощью зонда. Убедитесь, что все края мембраны из PDMS отделены и готовы к извлечению. После этого можно использовать морозильную камеру, чтобы снять мембрану из PDMS; при извлечении PDMS с верхней части устройства перемещайте его очень медленно, чтобы не разорвать мембрану из PDMS.

Теперь я помещу сверху мембрану из PDMS с полостями, сформированными с помощью мастер-матриц SC 8, и убежусь, что она лежит плоско. Мы делаем это для того, чтобы при создании отверстий — входных и выходных портов — поверхность PDMS с той стороны, которая будет приклеиваться к покровному стеклу, оставалась гладкой.

Таким образом, необходимо убедиться, что полости расположены на верхней стороне. Теперь мы можем создать входной и выходной порты, чтобы отверстия были четко видны. Для этого мы установим черный фон.

Теперь я сформирую входной и выходной порты; необходимо убедиться, что в области портов не осталось PDMS. Поэтому мы удаляем излишки PDMS. Теперь мы перенесем мембрану из PDMS на другой прозрачный лист.

Таким образом, мы можем обработать плазмой лист и покровное стекло, затем уложить их так, чтобы полости снова оказались сверху. После того как эта поверхность и покровное стекло будут обработаны плазмой, мы сможем соединить эти две поверхности для формирования микрофлюидной сети и удаления пузырьков воздуха между листами PDMS. Для обеспечения прозрачности можно использовать клейкую ленту.

Это обеспечит плоскость листа PDMS и значительно улучшит качество склеивания. Затем снова используйте клейкую ленту на верхней поверхности, чтобы удалить пыль с мембраны PDMS. Теперь можно поместить покровное стекло, которое будет приклеено к мембране PDMS.

Теперь эти два образца PDMS и стекло готовы к плазменной обработке. Мы обработаем PDMS и покровное стекло с помощью этой модифицированной микроволновой плазменной системы; вы видите, что эта стеклянная камера позволяет создавать плазму внутри микроволнового излучателя. Я помещу образцы внутрь и создам вакуум в камере.

Теперь я могу подать кислород. Плазменная система готова к работе; для визуализации плазмы в данной конкретной системе я буду использовать мощность 10% и время воздействия 10 секунд. Во время плазменной обработки мы увеличили мощность до 100% и выключили свет.

Теперь вы видите плазму сразу после обработки. Вам необходимо соединить обе поверхности — предметное стекло и PDMS, иначе поверхность PDMS потеряет гидрофильность, возникшую в результате воздействия плазмы. После размещения предметного стекла убедитесь, что вся поверхность плотно соединена без образования пузырьков воздуха.

Если появились пузырьки воздуха, их можно удалить. Теперь отложите камеру на пять минут для полимеризации. Перед нами модифицированная перфузионная камера, основание которой мы модифицировали с помощью PDMS.

Это было сделано ранее. Мы поместили прозрачную подложку на выключенную нагревательную плитку. Затем мы вылили PDMS, который был подготовлен аналогичным образом, как показано ранее.

Затем мы поместили перфузионную камеру поверх PDMS, установили один груз, как показано здесь, и оставили ее отверждать на 30 минут при 75 °C. Теперь, пока мы ждем завершения склеивания PDMS и покровного стекла, я покажу, как можно подготовить камеру. Таким образом, мы сможем соединить камеру и микрофлюидное устройство.

Таким образом, нам необходимо удалить излишки PDMS из тех мест, где они не требуются. Снимите прозрачную пленку, затем удалите PDMS. После этого следует очистить от PDMS входной и выходной порты. Теперь камера готова к соединению с микрофлюидным устройством, которое мы подготовили ранее.

После пятиминутного ожидания микрофлюидное устройство готово к отделению от прозрачной пленки; при этом важно удалять пленку медленно, чтобы PDMS и покровное стекло не отделились друг от друга. Теперь, когда перфузионная камера готова, необходимо обработать плазмой нижнюю поверхность камеры, где был нанесен PDMS, и верхнюю поверхность микрофлюидного устройства с нанесенным PDMS.

Теперь мы поместим обе эти детали в плазменную камеру и проведем плазменную обработку при мощности 10% в течение 10 секунд. Теперь обе поверхности обработаны плазмой и готовы к склеиванию. Перед склеиванием необходимо убедиться, что входные и выходные порты камеры совмещены с микрофлюидным устройством.

Поскольку совмещаемые элементы достаточно велики, специальное оборудование не требуется, и это можно сделать невооруженным глазом. После совмещения и размещения сверху на камере убедитесь, что все поверхности плотно прилегают друг к другу, а затем оставьте конструкцию на пять минут. По истечении пяти минут соединение будет достаточно прочным для проведения экспериментов.

Теперь, когда микрофлюидное устройство было соединено с камерой, нам необходимо сделать поверхности каналов гидрофильными. Это позволит раствору A CFS или любым другим нейромедиаторам протекать по каналам более легко. Для этого я помещу все устройство в установку для плазменной обработки и обработаю его плазмой в течение одной минуты при мощности 10%, чтобы все внутренние поверхности каналов стали гидрофильными.

Затем я наполню его водой и перенесу на установку для электрофизиологических исследований, чтобы мы могли приступить к проведению экспериментов. Итак, теперь мы готовы перейти к установке для электрофизиологии и фактически использовать это устройство со срезом мозга. Здравствуйте, меня зовут uo.

Я работаю с доктором Аррингтоном и доктором Фоллом на кафедре биоинженерии Университета Иллинойса. Сейчас я буду работать с устройством для микрофлюидики, которое я принес и установил на эту платформу. С одной стороны мы видим трубки для перфузии.

С другой стороны мы видим всасывающую трубку. Таким образом, устройство будет перфузировано раствором ЦСЖ, насыщенным 95% кислорода и 5% CO2. Теперь, когда устройство micro V готово, я возьму срезы мозга и помещу их на микроустройство.

Теперь я помещу срез мозга на верхнюю часть круглых отверстий, а затем использую зажимы для его иммобилизации. После того как срез мозга будет зафиксирован, я применю нейромедиаторы для его стимуляции. Здесь у нас есть четыре входных отверстия, поэтому я введу нейромедиатор в каждое из них, используя пассивную перекачку из этих четырех входов в данный выход.

А теперь доктор Фолл расскажет об этом устройстве и о том, почему оно так важно для нас. Здравствуйте, я Крис Фолл, мы занимаемся физиологией мозга.

Причина, по которой нам необходимо использовать срезы мозга, заключается в обеспечении доступа для микроэлектродов и технологий визуализации. До настоящего времени единственным способом изменения нейромедиаторного окружения этих срезов мозга была смена потока жидкости над всем срезом или прямое введение нейромедиаторов с помощью очень маленькой микропипетки. Поэтому мы очень рады сотрудничеству с группой Эддингтона.

Эта новая технология позволит нам воздействовать на обширные области мозга и локально изменять среду нейромедиаторов. После этого мы сможем одновременно использовать электроды и методы визуализации, а в перспективе, возможно, интегрировать многоэлектродные системы регистрации в один блок. Итак, здесь вы видите срез мозга мыши в микрофлюидном устройстве.

Даже визуально можно заметить, что мозг состоит из множества различных областей. Эти области выполняют разные функции. У живого животного в этих различных областях мозга будет разный нейромодуляторный и нейротрансмиттерный тонус.

Мы хотим иметь возможность воспроизвести это в нашей камере для срезов во время проведения электрофизиологических записей и визуализации. Поэтому очень удобно иметь возможность воздействовать на эти различные области разными нейромедиаторами в различных концентрациях и с разным временным ходом. И хотя мы не можем визуализировать нейромедиаторы напрямую, мы можем показать вам здесь пример того, как флуоресцентный краситель нагнетается в различные области среза мозга.

Здесь представлен ролик, в котором мы пропускаем флуоресцентный краситель через каналы устройства и визуализируем его выход из созданных пор. Даже в этом раннем прототипе видно, насколько точно соблюдается пространственное разрешение потока. При просмотре видео вы увидите, как краситель поступает в каналы, а затем выходит через отверстия; после этого мы промоем систему от красителя, что позволит вам представить временное разрешение потока.

Благодарим вас за внимание. Я полагаю, нам удалось продемонстрировать, как микрофлюидика и, по сути, микромашины могут быть интегрированы с традиционными физиологическими методами, чтобы помочь нам понять принципы работы мозга. Спасибо.