Визуализация РНК Локализация в Xenopus Ооцитов

В данной процедуре в ооциты Xenopus laevis вводятся флуоресцентно меченные РНК-транскрипты, после чего отслеживается их локализация. Сначала РНК метят флуоресцентными нуклеотидами.

После проведения реакции транскрипции in vitro РНК загружают в аппарат для микроинъекций. Ооциты помещают в чашку для инъекций и осторожно проводят микроинъекции. Наконец, ооциты культивируют, чтобы обеспечить локализацию РНК перед визуализацией на конфокальном микроскопе.

Здравствуйте, я Джеймс Ганнан из лаборатории доктора Кимберли Мэллори кафедры молекулярной биологии, клеточной биологии и биохимии Университета Брауна. Сегодня мы продемонстрируем вам процедуру визуализации субклеточной локализации РНК в ооцитах Xenopus. Мы используем этот метод в нашей лаборатории для изучения архитектуры РНК и белковых факторов, необходимых для локализации РНК на ранних стадиях развития позвоночных.

Итак, приступим. Для начала этой процедуры проведите транскрипцию мРНК с радиоактивной и флуоресцентной метками, как описано в прилагаемом письменном протоколе. Добавьте DNase для деградации матрицы ДНК, а затем остановите реакцию, добавив EDTA.

Удалите неиспользованные нуклеотиды и другие малые молекулы, пропустив образец через колонку G 50. Затем РНК концентрируют путем осаждения этанолом, промывают и ресуспендируют. После определения концентрации методом сцинтилляционного подсчета разбавьте РНК до 50 nM и храните в аликвотах по 5 µL при температуре -80 °C.

Когда вы будете готовы приступить к микроинъекции, разморозьте аликвот метки labeled RNA, денатурируйте при 70 °C в течение пяти минут. Затем центрифугируйте в течение 10 минут на максимальной скорости в микроцентрифуге при комнатной температуре для удаления твердых частиц и храните на льду. Далее изолируйте ооциты: поместите фрагменты яичника Xenopus laevis в коническую пробирку объемом 50 мл, содержащую 25 мл раствора с концентрацией 3 mg/mL.

Коллагеназа в 0,1 M калий-фосфатном буфере при pH 7.4. Осторожно встряхните при 18 °C, так как характеристики могут варьироваться от партии к партии. Время обработки коллагеназой может меняться и должно тщательно контролироваться путем визуального осмотра.

Чтобы обеспечить дефолиацию, продолжайте встряхивание в течение 15 минут или до тех пор, пока ооциты заметно не отделятся от яичника; дайте ооцитам осесть на дно конической пробирки. Удалите раствор и замените его буфером MBSH. Повторите это действие, промыв дважды, чтобы всего было три промывки.

Затем с помощью стандартного светового микроскопа вручную отберите циты третьей и четвертой стадий в буфере MBSH. Циты третьей стадии полностью непрозрачные, но белого цвета. В то время как циты четвертой стадии немного крупнее и имеют пигментные вкрапления.

Ооциты, которые слегка прозрачны, слишком молоды, а ооциты, которые полностью пигментированы или демонстрируют поляризованное распределение пигмента, слишком стары. Наконец, подготовьте иглы для микроинъекций, используя капилляры длиной три с половиной дюйма, вытягивая и срезая их для создания игл с внешним диаметром примерно 0,05 мм. Теперь, когда мРНК, ооциты и иглы готовы, переходите к микроинъекции.

Начните с калибровки иглы с использованием деионизированной воды, чтобы обеспечить введение 2 нл за одну инъекцию. Заполните иглу с помощью микроинъектора с газовым управлением и измерьте размер капли с помощью микрометра; после калибровки заполните иглу РНК, предназначенной для инъекции. Затем поместите отсортированные ооциты в чашку для инъекций с буфером MBSH; чашка содержит слой черной вспененной резины.

Белые ооциты хорошо видны на черном фоне. Затем осторожно введите в каждый ооцит по 2 liters РНК в концентрации 50 nanomolar. Убедитесь, что в каждый ооцит ввели раствор только один раз, и после завершения инъекции регулярно проверяйте иглу на наличие засоров.

Удалите оставшуюся РНК, промойте иглу деионизированной водой и загрузите следующую порцию РНК для инъекции. После инъекции перенесите обработанные циты в лунку стерильного 24-луночного планшета; в каждой лунке можно культивировать до тысячи ЦИТОВ.

Удалите буфер и замените его 400 microliters культуральной среды для ооцитов на каждую лунку. Затем поместите культуральную пластину в пластиковый контейнер с влажным бумажным полотенцем для поддержания влажной среды в процессе культивирования; инкубируйте ооциты при 18 degrees Celsius в течение времени от восьми до 48 часов после завершения желаемого периода инкубации. После инкубации инъецированных ооцитов их можно подготовить к микроскопии.

Отберите все погибшие ооциты, а выжившие поместите в стеклянные флаконы. Обычно наблюдается выживаемость более 90% ооцитов. Замените буфер фиксатором M-E-M-F-A и осторожно перемешивайте ооциты в течение 20 минут.

После завершения периода фиксации берегите ооциты от воздействия солнечного света. Промойте ооциты, удалив фиксатор и заменив его равным объемом буфера MBSH. Повторите эту процедуру еще раз, чтобы в общей сложности выполнить две промывки.

Затем перенесите ооциты в безводный метанол. Сначала удалите половину объема и замените ее метанолом. Повторите эту процедуру еще дважды.

После этих промывок удалите весь раствор и замените его метанолом. Повторите промывку метанолом еще один раз. Фиксированные и дегидратированные ооциты можно хранить при температуре -20 °C до начала визуализации.

Перед визуализацией добавьте просветляющий раствор Мари в стеклянную флуоресцентную чашку WPI, чтобы покрыть поверхность сканирования. Осторожно перенесите ооциты из метанола в флуоресцентную чашку, стараясь минимизировать объем переносимого метанола. Визуализируйте ооциты на инвертированном конфокальном микроскопе; хорошие результаты дают как Zeiss LSM 510, так и Leica TCS SP. Сейчас мы представим репрезентативные изображения субклеточной локализации РНК сразу после микроинъекции: флуоресцентную РНК можно наблюдать в ядре, а спустя восемь часов культивирования флуоресцентно меченого контроля — в ином распределении.

РНК распределена равномерно по цитоплазме ооцита. Однако флуоресцентно меченная РНК, содержащая последовательности, привлекающие транспортный аппарат, может быть обнаружена в процессе субклеточной локализации у вегетативного полюса ооцита. Мы только что продемонстрировали способ микроинъекции флуоресцентно меченных РНК в ооциты и наблюдения за локализацией РНК с помощью конфокальной микроскопии.

При выполнении данной процедуры важно использовать обработанные растворы, чтобы избежать загрязнения культуры РНК, культивировать ооциты в среде OCM с антибиотиками и по возможности оберегать ооциты от солнечного света, чтобы избежать фотовыцветания. На этом всё. Спасибо за просмотр и удачи в ваших экспериментах.