Подготовка индивидуальных Drosophila Яйцо палат для работы с изображениями Онлайн

Целью следующего эксперимента является регистрация динамических процессов в живых U-узлах дрозофилы. Для этого сначала выделяют целые яичники из сытых двухдневных самок мух. На втором этапе из яичников извлекают отдельные антенные структуры для визуализации яйцекамер.

Затем, если они экспрессируют соответствующий флуоресцентный белок, отдельные яйцевые камеры можно визуализировать напрямую или подвергнуть дальнейшим манипуляциям, таким как микроинъекция флуоресцентных маркеров перед визуализацией. В конечном итоге, путем анализа последовательностей видеозаписей можно выявить динамическое взаимодействие внутриклеточных компонентов. Этот метод помог нам ответить на некоторые ключевые вопросы в области транспорта РНК и локализованной трансляции.

Например, как во времени и пространстве регулируется экспрессия белков, определяющих план строения тела в живом организме? Как правило, лица, впервые использующие данный метод, могут столкнуться с трудностями, так как он требует значительной скорости и ловкости рук. С практикой результаты будут улучшаться.

Визуальная демонстрация этого метода имеет решающее значение, так как манипуляции с яйцевыми камерами сложно передать текстом и они требуют технического опыта и твердой руки исследователя. Начните процедуру, поместив небольшую каплю галокарбонового масла на покровное стекло, и отложите его в сторону. Затем анестезируйте подготовленных мух углекислым газом.

Используя острый тонкий пинцет, захватите упитанную самку мухи в передней части брюшка. Не захватывайте насекомое в центре брюшка. Удерживайте самку примерно в двух-трех сантиметрах над подготовленным покровным стеклом.

С помощью второй пары пинцетов удалите ткани в крайней задней части самки. Обычно вместе с ними чистым пинцетом удаляются ткани кишечника. Осторожно массируйте брюшко от переднего к заднему концу, подобно тому как выдавливают зубную пасту из тюбика.

Яичники выглядят как крупные непрозрачные структуры и прилипают к концу пинцета. Соберите яичники, прикоснув их к гало-карбоновому маслу на предметном стекле. Повторяйте эту процедуру до тех пор, пока не будет собрано от четырех до шести яичников.

Перед выделением антенн отрегулируйте источник света микроскопа так, чтобы освещение падало на предметное стекло под малым углом, создавая контрастные тени на тканях. При диссекции мух крайне важно использовать подходящие инструменты.

Используемый нами зонд не слишком острый, чтобы не повредить ткани, но достаточно тупой, чтобы мы могли зафиксировать пинцет. Аналогично, пинцет не должен быть слишком острым, чтобы не травмировать ткани, но при этом достаточно прочным, чтобы манипулировать объектами, не сгибая инструмент. Также крайне важно поддерживать чистоту инструментов, поэтому мы регулярно очищаем их в ходе процедуры, используя закрытый зажим.

Разделите два яичника, удалив соединительную ткань на заднем конце. На заднем конце расположены наиболее зрелые яйцевые камеры. Расположите яичник горизонтально так, чтобы самые молодые яйцевые камеры находились со стороны вашей доминирующей руки.

Затем осторожно захватите задний конец за оставшуюся соединительную ткань и с помощью диссекционного зонда или вольфрамовой иглы выделите отдельные ариулы; яичные камеры от стадии Jamar до стадии 10 будут отделяться друг от друга, тогда как более старые яичные камеры останутся прикрепленными к яичнику. С помощью зонда аккуратно переместите от 15 до 25 отделенных ариул в центр капли масла. Если требуется препарировать более одного яичника, возьмите их от разных мух.

Удалите излишки ткани яичника и действуйте быстро, так как циты начнут проявлять фенотипические изменения вследствие стресса. Через 40 минут после выделения из яичника удалите излишки ткани яичника из масла. Используя чистые инструменты для инъекции цитов средней стадии, расположите аэриалы перпендикулярно длинной оси покровного стекла. Для изоляции яйцевых камер поздней стадии.

Для захвата задней части яичника, описанного ранее, требуется другой метод. Введите диссекционный зонд в задний конец яичника рядом с пинцетом. Чтобы избежать прокалывания яйцевых камер, вводите зонд между яйцевыми камерами на поздних стадиях развития.

Проведите препарировочную иглу сквозь яичник до ее выхода в области яйцевых камер на ранней стадии развития. При правильном выполнении зонд удалит соединительную ткань, удерживающую овариолы и яйцевые камеры на поздней стадии развития. Повторяйте это действие до тех пор, пока овариолы не распределятся по покровному стеклу.

Когда яйцевые камеры больше не расположены друг над другом, этот этап завершен. С помощью диссекционного зонда разделите яйцевые камеры на поздних стадиях развития, чтобы облегчить визуализацию для позиционирования камер стадии 14. Используйте пинцет, чтобы захватить их дорсальные придатки.

Подготовьте растворы для инъекций, подвергнув их кратковременному центрифугированию на высокой скорости. Это позволит осадить любые твердые частицы, которые могут забить иглу для инъекций. Затем с помощью наконечника для загрузки заполните иглу и осторожно закрепите заполненную иглу в инжекторе.

Теперь поместите небольшой кусочек стекла рядом с образцами и установите предметное стекло на предметный столик микроскопа. Стекло будет служить перегородкой для разрыва или размыкания. Извлеките иглу.

Подготовьте микроскоп и аппарат для инъекций к проведению эксперимента, стараясь не повредить кончик иглы. По возможности используйте автоматизированный предметный столик с функцией перемещения по заданным точкам, чтобы отметить все клетки стадий восемь и девять для проведения инъекций.

Теперь опустите иглу для инъекции до тех пор, пока она не коснется масла. Выберите первую точку в списке отмеченных точек и сфокусируйтесь на клетке. Вручную опустите иглу, пока она не окажется в той же плоскости фокусировки, что и клетка.

С помощью органов управления манипулятора переместите кончик инъекционной иглы так, чтобы он оказался внутри участка U. Быстрое прокалывающее движение зачастую более эффективно, чем медленное. После введения выпустите из иглы небольшой объем вещества и визуально оцените полученный эффект.

Требуется повторение. При успешном введении жидкости цитоплазма внутри клетки будет вытеснена. Точный объем введенной жидкости трудно количественно определить.

Для увеличения объема инъекции отрегулируйте давление или продолжительность импульса инъекции. Слегка отломите кончик иглы, чтобы немного расширить отверстие, или просто используйте несколько импульсов инъекции перед выбором следующей клетки. Поднимите иглу для инъекций достаточно высоко в масле, чтобы она не задевала другие клетки.

Многократные проколы или длительное удерживание иглы внутри циста серьезно повреждают яйцевую камеру. Поэтому действуйте быстро. Инъекция должна занять менее 10 секунд.

В случае ошибки переходите к следующей метке участка. Не тратьте время на поврежденные участки. Если игла засорится, переместите ее в осколок стекла.

Установив стекло и иглу в одну фокальную плоскость, осторожно введите иглу в стекло. Убедитесь, что игла не засорена, нажав кнопку инъекции и проверив, выходит ли жидкость из кончика иглы. После проведения инъекций во все участки УЗ вручную извлеките иглу из масла и расположите ее вне траектории луча микроскопа.

Убедитесь, что образец расположен безопасно, чтобы избежать повреждения глаз, и что свет выключен. Для ускорения флуоресцентной визуализации критически важна скорость работы. Если между выделением яйцевых камер и инъекцией в циты прошло более одного часа, инъекции в циты будет сложно провести, и они будут проявлять фенотипические изменения, связанные со стрессом.

Аналогичные проблемы могут возникнуть при грубом обращении с цитом или введении избыточных объемов. Камеры яиц, экспрессирующие тренчгенные флуоресцентные белки, можно визуализировать без необходимости инъекции. Маркировка эндогенной РНК с помощью MS two может быть визуализирована с хорошими результатами, используя процедуры изоляции тканей с применением полного метода синтеза in vitro.

РНК Alexa, 5 46 kin была введена в яйцеклетку ME 31 BGFP; РНК локализовалась в дорсальной передней части циста и образовала вокруг ядра колпачок. После освоения эта методика занимает около 10 минут от момента диссекции до начала визуализации. При выполнении данной процедуры бережно относитесь к ткани, работая быстро, но осторожно. После просмотра этого видео вы должны получить четкое представление о том, как регистрировать динамические процессы в живых цистах Drosophila.