Робототехника и динамического анализа изображения для исследования экспрессии генов в тканях растений

В данной процедуре с помощью робототехники осуществляется визуализация динамики экспрессии генов в тканях растений в течение определенного времени; сначала семена лимской фасоли стерилизуют и помещают между увлажненными бумажными полотенцами в контейнер для культуры тканей для прорастания. Через четыре дня коттиледоны извлекают и подвергают бомбардировке ДНК-конструктом, содержащим промотор, слитый с GFP. Коттиледоны, помещенные в чашки Петри, устанавливают в двумерную специально разработанную роботизированную систему сбора изображений. Робот запрограммирован делать снимки каждого фрагмента ткани каждый час в течение 100 часов.

Изображения подвергаются анализу для получения количественных данных об интенсивности экспрессии GFP с течением времени. Здравствуйте, я Джон Файнер, директор Лаборатории трансформации растений кафедры садоводства и растениеводства Университета штата Огайо. Я Карлос Эрнандес Гарсия, аспирант той же лаборатории Университета штата Огайо.

Сегодня Карлос продемонстрирует протокол, который мы разработали для анализа экспрессии генов в растительных тканях с помощью зеленого флуоресцентного белка. Мы используем эту разработанную в нашей лаборатории процедуру для измерения активности промотора OD. Для этого мы клонировали данный промотор выше гена GFP, который служит нам репортерным геном.

Я продемонстрирую вам, как мы вводим промоторный контроль в катализу в жилку листа фасоли (Lima bean) и фиксируем результаты с помощью нашей специализированной роботизированной системы захвата изображений. В завершение я разберу наш протокол анализа изображений. Итак, приступим. Для начала данной процедуры семена фасоли стерилизовали на поверхности стандартными методами.

Поместите стерилизованные семена в контейнеры Magenta GA 7 между слоями влажных бумажных полотенец и инкубируйте их в течение четырех дней при 25 °C. Здесь мы используем экспрессионный вектор с высоким числом копий, подходящий для анализа промоторов и их элементов. Этот вектор содержит ген GFP, который используется для визуализации функции промотора или его элемента в трансформированных тканях примерно за один-два часа до бомбардировки.

Вырежьте котиледоны фасоли *Phaseolus lunatus* из семенных оболочек. Котиледоны, подходящие для бомбардировки, должны иметь желтый или светло-зеленый цвет, быть плоскими и не иметь повреждений, которые могли бы помешать последующему анализу изображений. Сразу после вырезания поместите 12 котиледонов в чашку Петри с культуральной средой OMS, содержащей соли MS, пять витаминов, 3% сахарозы и 0,2% гелрата при pH 5.7. Затем осадите ДНК-конструкцию на частицы вольфрама M 10. Сначала, непосредственно перед использованием, ресуспендируйте частицы в стерильной воде до концентрации 100 mg/mL.

Затем в центрифужную пробирку объемом 0.6 мл добавьте 25 µL частиц, 5 µL ДНК в концентрации 1 µg/µL, 25 µL 2.5 M хлорида кальция и 10 µL 100 mM спермина. Инкубируйте препарат ДНК на льду в течение пяти минут, затем удалите и утилизируйте 50 µL раствора, находящегося над частицами. Ресуспендируйте покрытые ДНК частицы, оставшиеся на дне пробирки, путем вортексирования.

Сразу после вортексирования отберите 2 µL элюата. Повторите этот этап вортексирования. После каждого отбора элюата покрытые частицы следует хранить на льду и использовать в течение 15 минут.

После того как частицы были покрыты ДНК, нанесите 2 µL частиц на верхнюю часть шприцевого фильтра, расположенного в центре фильтрующего экрана. Затем установите шприцевый фильтр в блок крепления фильтра внутри камеры подачи частиц (PIG). Поместите образец фасоли (lima bean) axial side up на перегородку, представляющую собой экран, вплавленный в дно стакана.

Установите перегородку, которая служит платформой для поддержки тканей во время облучения в камере ионного пушки. Для облучения ткани сначала откройте клапан, ведущий к вакуумному насосу, чтобы откачать воздух из камеры. Когда давление достигнет 760 миллиметров ртутного столба, активируйте соленоид и выпустите гелий для ускорения частиц.

Для ускорения частиц используется давление гелия от 50 до 60 PSI. После бомбардировки частиц закройте клапан вакуумной линии и сбросьте вакуум с помощью выпускного клапана. После сброса вакуума откройте дверцу камеры, чтобы извлечь облученный co leadin и вернуть co leadin a dal side.

Используйте питательную среду OMS для количественного анализа и профилирования экспрессии. Проведите бомбардировку минимум трех образцов для каждой ДНК-конструкции. Также включен положительный контроль, который обеспечивает хорошо изученный профиль экспрессии генов.

Теперь ко-лидины готовы к визуализации. Включите ртутную лампу и подождите 30 минут до ее разогрева. Включите источники питания для камеры SPOT R-T-C-C-D и контроллера двигателей, который управляет перемещением специально разработанной робототехнической платформы, удерживающей восемь планшетов.

Настройте набор фильтров для детектирования GFP, выбрав в микроскопе MZ L3 набор фильтров GFP два с возбуждением на 480 нанометрах и эмиссией на 510 нанометрах. Затем стерилизуйте крышки из утолщенного поликарбоната для чашек Петри, распылив 70% ethanol. Специальные крышки, используемые для накрытия основания чашки Петри, предотвращают образование конденсата во время получения изображений.

Поместите планшеты с облученными образцами cuan на роботизированную платформу и затяните боковой стопорный винт для их фиксации. Откройте специализированное программное обеспечение для управления роботизированной платформой и сбором изображений. Затем с помощью программы включите контроллер белого света и переведите платформу в исходное положение.

Это выполняется перед переходом к позиционированию. Для каждого направляющего модуля в данной вкладке двигателя выберите первую планшетку. Платформа установит центр чашки Петри точно под объективом микроскопа.

Используя кнопки перемещения, точно позиционируйте первый CU LEADIN для сбора изображений. С помощью функции режима реального времени переместите cuddle leaden в соответствующую область обзора. Для первого cuddle leaden используйте ручки настройки диссекционного микроскопа для фокусировки и установите увеличение 1,6 x. После того как интересующая область будет определена, нажмите кнопку добавления данной позиции.

Программное обеспечение добавит координаты этой области в файл расписания позиций, и платформа вернется в центр планшета, установленного в позициях для всех остальных коанов на планшетах. Используя кнопки перемещения, с помощью трех винтов ручной регулировки, расположенных под каждым планшетом на роботизированной платформе, отрегулируйте фокус для остальных коанов на том же планшете. После ввода всех координат всех коанов сохраните координаты расписания позиций.

Введите параметры сбора изображений, такие как тип освещения (для GFP используется синий свет) и настройки экспозиции, а также укажите место сохранения изображений, как описано в прилагаемом письменном протоколе. Перейдите на вкладку управления временем съемки (capture time control) и установите интервал между снимками и общее количество циклов сбора изображений. Обычно изображения собирают каждый час в течение 100 часов.

Получение четко выраженных профилей экспрессии генов. Начните сбор изображений, открыв вкладку графика позиций (position schedule), а затем нажав кнопку запуска графика (run schedule). По завершении 100-часового сбора изображений изолируйте систему получения изображений от постороннего света.

Изображения высокого разрешения объемом около пяти мегабайт каждое готовы к анализу. Используйте программу ImageReady для сборки 100 последовательных изображений из каждой папки. Импортируйте все последовательные изображения в качестве кадров и измените их размер до 800 на 600 пикселей для ускорения обработки изображений.

Затем нанесите метки на новом введенном слое, который виден на всех кадрах, используя выбранные GFP-споты в качестве ориентира на изображении. Вручную выровняйте каждое изображение; по завершении выравнивания удалите слой, использовавшийся в качестве ориентира, и сохраните файл в формате PSD. Также экспортируйте все кадры в один MOV-файл с максимально возможным разрешением.

Теперь файлы готовы к количественному определению GFP. Используйте Image J для открытия MOV-файла и обрежьте область размером 400 на 300 пикселей. Затем разделите последовательные изображения на красный, синий и зеленый каналы, используя инструмент RGB split для красного и зеленого каналов.

Вычтите фоновую флуоресценцию, используя инструмент плагина «subtract measured ROI» для каждого среза. Рассчитайте экспрессию GFP, отрегулировав уровни порога и используя плагин, предназначенный для измерения среднего значения серой шкалы на пиксель и общего количества пикселей, экспрессирующих GFP. Скопируйте полученные значения в ImageJ. Наконец, вставьте значения для зеленого и красного каналов в Microsoft Office.

Excel для дальнейшей обработки данных, чтобы дать вам представление о результатах совмещения изображений. На этой первой анимации показана неточность репозиционирования роботизированной платформы в ходе 100-часового эксперимента. Движение пятен является артефактом, возникшим из-за невозможности роботизированной платформы вернуться в точно такое же положение в каждый момент времени; после ручного совмещения изображений клетки, экспрессирующие GFP, становятся отчетливо видны, и уникальные особенности этой системы трекинга легко визуализируются.

При повторении этой анимации обратите внимание на обведенные клетки, экспрессирующие GFP: в клетке, обведенной красным, наблюдается очень резкое снижение экспрессии через 18–20 часов после бомбардировки, в то время как в клетке, обведенной белым, наблюдается задержка начала экспрессии GFP. Помимо визуализации, данная процедура позволяет проводить быструю количественную оценку экспрессии GFP с течением времени в целевой ткани фасоли лимы. Эти репрезентативные результаты демонстрируют сравнительный количественный анализ интенсивности промоторов с использованием промотора CAMV 35 S и четырех различных промоторов сои.

Мы только что продемонстрировали вам способ введения ДНК в котиледоны проростков. Мы поместили семена лимы на робот, собрали изображения для анализа и проанализировали их. В нашей лаборатории эта процедура регулярно используется для валидации клонированных растительных промоторов.

Введение различных растительных промоторов позволяет получить большой объем данных. Однако эта процедура осложнена множеством этапов, на которых могут возникнуть ошибки; поэтому при ее выполнении важно начинать с семян фасоли свежей линии или, по крайней мере, использовать высококачественные семена, хранившиеся надлежащим образом. Также важно быстро подготовить крышку чашки Петри для бомбардировки, установить ее на робота и использовать толстую крышку чашки Петри, чтобы свести к минимуму проблемы с конденсацией.

И наконец, пожалуйста, обратите внимание, что используемый нами GFP — это другая версия под названием SGFP, созданная в лаборатории Gen HIN в Гарвардском университете. Этот GFP не очень стабилен, что может быть более эффективно для отслеживания быстрых изменений в экспрессии генов. На этом всё, спасибо за просмотр.

И удачи в ваших экспериментах.