Сотовые конкретного анализа

Общая цель данной процедуры заключается в выделении популяции протопластов специфического типа клеток из листа. Для этого сначала выращивают растения, экспрессирующие GFP в конкретных типах клеток листа. На втором этапе проводят сбор листьев и получение протопластов с помощью ферментативного переваривания.

Затем протопласты фильтруют и сортируют с помощью метода флуоресцентно-активированной сортировки клеток (FACS). Заключительным этапом является подтверждение точности сортировки с помощью флуоресцентной микроскопии. В конечном итоге отсортированные протопласты можно использовать для анализа экспрессии генов, специфичных для данного типа клеток, протеомного анализа или метаболического профилирования.

Метод флуоресцентной сортировки клеток ранее успешно применялся для корневой системы, однако в данном случае он используется для изоляции клеток листа. Применение меток GFP перед использованием этого метода было ограничено из-за помех, создаваемых флуоресценцией хлорофилла. Визуальная демонстрация данного метода имеет решающее значение, так как быстрая, но тщательная подготовка образцов крайне важна для минимизации значительных физиологических изменений, которые могут возникнуть в процессе сортировки клеток.

Как правило, лица, впервые применяющие данный метод, могут столкнуться с трудностями из-за отсутствия навыков настройки клеточного сортера или способов подтверждения точности сортировки. Данный метод позволяет ответить на ключевые вопросы в области системной биологии растений. Проблема идентификации сетей генной регуляции в сложных многоклеточных органах, таких как лист, заключается в том, что различные типы клеток экспрессируют разные группы генов.

Эта генетическая информация теряется при анализе сбора всей поверхности листа. Демонстрация процедуры. Со мной будут Эллисон А. и Санджив Кумар, которые обеспечивают техническую поддержку этой работы в нашей лаборатории. Сначала наполните круглую чашку Петри диаметром 9 см 20 мл раствора А, содержащего ферменты для протопластирования, а также ингибиторы транскрипции и РНказ.

Затем соберите необходимый листовой материал для образцов, содержащих более одного листа, как показано в данном примере. Сложите листья в стопку высотой до 15 листов. Затем с помощью лезвия бритвы нарежьте листья полосками шириной 1 mm.

Немедленно перенесите полоски листьев в чашку Петри с помощью плоских пинцетов, осторожно разделите полоски, а затем проведите вакуумную инфильтрацию образцов дважды по пять минут за каждую процедуру. Затем поместите чашку Петри на орбитальный шейкер, установленный на 90 RPM при комнатной температуре, и инкубируйте образцы в течение трех-четырех часов. Во время инкубации каждые полчаса разделяйте полоски листьев друг от друга с помощью пинцета.

После завершения переваривания осторожно профильтруйте раствор протопластов через клеточный фильтр с размером ячеек 70 мкм в пробирку объемом 50 мл. Полоски листьев останутся на фильтре, а протопласты пройдут сквозь него.

Теперь используйте 4 мл раствора A для аккуратного промывания полосок листа, собирая промывочную жидкость в пробирку объемом 50 мл. Затем перенесите суспензию протопластов в пробирки с круглым дном и центрифугируйте протопласты в течение 5 минут при 300 ×g и комнатной температуре. Осторожно, чтобы не повредить осадок, максимально удалите супернатант с помощью аспиратора, а затем промойте протопласты 5 мл раствора A при тех же условиях центрифугирования.

Наконец, после удаления верхнего слоя суспензии, используйте наконечник P 1000 с обрезанным концом, чтобы ресуспендировать ПРОТОПЛАСТЫ в соответствующем объеме раствора A непосредственно перед сортировкой. Используйте целый наконечник P 1000, чтобы разбить любые комки в растворе протопластов. Дополнительно диссоциируйте клетки, профильтруйте протопласты в пробирку для сортировки через нейлоновый фильтр с размером пор 50 мкм.

Затем разбавьте клеточную суспензию соответствующим образом, чтобы избежать засорения сопла забора клеток. После определения оптимальных условий забора клеток идентифицируйте GFP-положительные протопласты с помощью 488-нанометрового лазера Argonne, сравнивая сигнал на выходе полосового фильтра 580/30 с сигналом полосового фильтра 530/40. Обратите внимание, что GFP-положительные протопласты будут находиться в популяции с высоким уровнем сигнала 530 и низким уровнем сигнала 580.

При наличии популяции протопластов без GFP в области низких значений 530 и 580, погибшие или погибающие протопласты и клеточный дебрис оказываются в популяции с высокими значениями 580. Для визуализации отсортированных протопластов с помощью флуоресцентной микроскопии сортируйте их непосредственно в объем раствора A, превышающий объем образца как минимум в восемь раз; после сортировки сконцентрируйте протопласты путем центрифугирования. Протопласты могут быть отсортированы в восемь объемов раствора A и собраны для визуализации на флуоресцентном микроскопе с целью подтверждения обогащения. На этом первом изображении представлен пример обогащения клеточной линии TP 382, которая экспрессирует GFP в замыкающих клетках. Примеры выхода, полученного данным методом как до, так и после амплификации, обобщены в этой таблице.

Количества в диапазоне от 500 пикограмм до 50 нанограмм достаточны для амплификации с помощью системы ovation PICO WTA и последующего анализа методом количественной ПЦР, секвенирования следующего поколения или микрочипирования. На следующей серии изображений представлены различные клеточные линии протопластов, выделенные и отсортированные описанным выше методом. Первые протопласты были получены из листьев KC 2 74, представлен поперечный срез KC 2 74.

На листе видно, что GFP экспрессируется в сосудистой системе. Эти протопласты были выделены из листьев KC 4 64, а поперечный срез листа KC 4 64 показывает, что экспрессия GFP наблюдается в эпидермисе A dal. Наконец, эти протопласты были получены из листьев TP 3 82 в листьях TP 3 82.

Здесь GFP экспрессируется в замыкающих клетках. Показаны типичные точечные диаграммы сбора данных, иллюстрирующие выход с полосовых фильтров 580±30 нм и 530±40 нм. Обозначены гейты сортировки, которые обычно используются в процессе селекции.

Этот первый график с точечной диаграммой протопластов, полученных из листьев Arabidopsis thaliana Col-0, которые были подвергнуты протопластированию в отсутствие ингибиторов, показывает одну популяцию с низкими значениями 530 и 580. В то время как эта точечная диаграмма протопластов, полученных из листьев Arabidopsis thaliana Col-0 дикого типа и подвергнутых протопластированию в присутствии ингибиторов, демонстрирует сдвиг флуоресценции 580, который происходит из-за стресса и окрашивания, вызванного ингибиторами. Данные точечные диаграммы относятся к протопластам листьев линий KC 74, KC 4 64 и TP 3 82 соответственно.

Эти образцы также были проанализированы в присутствии ингибиторов, что показало локализацию GFP в популяциях с высоким уровнем 530 и низким уровнем 580. Для данного репрезентативного эксперимента по количественной ПЦР сначала были получены образцы для каждого типа фракций. Затем образцы были амплифицированы с использованием системы ovation PICO WTA и количественной ПЦР.

Было проведено использование GFP-специфичных праймеров. Показанные значения представляют собой максимальные (отмечены красным) и минимальные (отмечены зеленым) средние или единичные значения; горизонтальными желтыми полосами indicated указан ген актина 2 в качестве референсного гена. Результаты подтверждают данные оптической оценки содержания GFP в отсортированных фракциях клеток.

Популяция high 530 low 580 продемонстрировала самые высокие измеряемые уровни экспрессии GFP. В то время как в популяции high 530 high 580 экспрессия GFP была примерно в 1000 раз ниже, популяции low 530 low 580 и low 530 high 580 показали низкие уровни экспрессии GFP, сопоставимые с уровнями в контрольных популяциях целого листа и несортированных протопластов. После освоения эта методика может быть выполнена за четыре-пять часов от растения до отсортированной популяции клеток при условии правильного проведения процедуры. При выполнении данной процедуры важно помнить о необходимости постоянного мониторинга клеточного сортера и его повторной калибровки при необходимости для поддержания точности сортировки.

Данная процедура была найдена. Для сравнения и сопоставления уровней экспрессии генов в различных типах клеток могут быть использованы и другие методы, такие как микрочиповый анализ. Теперь, когда эта методика разработана, мы анализируем экспрессию генов в специфических типах клеток листа на разных стадиях развития и будем сравнивать полученные результаты с данными по всему листу, полученными в рамках проекта по агрономии.

После просмотра этого видео вы должны получить четкое представление о том, как изолировать отдельные типы клеток листьев с помощью метода сортировки клеток с флуоресцентной активацией.