Всеобъемлющее Композиционные Анализ стен растительной клетки (лигноцеллюлозной биомассы) Часть I: Лигнин

Определение содержания и состава лигнина в клеточных стенках растений начинается с использования высушенного растительного материала, который подвергается различным этапам экстракции. Полученный материал состоит только из клеточных стенок, после чего он разделяется для определения содержания лигнина. Материал стенок подвергается гидролизу ацетилбромидом, а полученные растворимые мономеры количественно определяются с помощью УФ-спектрометрии для анализа состава лигнина.

Материал клеточной стенки подвергается гидролизу путем цитолиза. Растворенные компоненты лигнина затем переводятся в летучие триметилсилильные производные, которые могут быть разделены и количественно определены с помощью газовой хроматографии в сочетании с масс-спектрометрией. Определение состава матричных полисахаридов и содержания целлюлозы продемонстрировано в другом видео под названием «Комплексный анализ состава клеточных стенок растений, часть вторая: Углеводы».

Здравствуйте, я Маркус Поули, руководитель аналитической лаборатории по исследованию клеточных стенок в Исследовательском центре биоэнергетики Великих озер при Университете штата Мичиган. А я, Клифф Фостер, менеджер аналитической лаборатории по исследованию клеточных стенок. Мы продемонстрируем вам процедуру определения содержания и состава образцов растической биомассы.

Растения преобразуют световую энергию солнца в химическую энергию, например, в биомассу. Биомасса растений состоит преимущественно из клеточных стенок — сложной сети различных полимеров, окружающих все растительные клетки. В данной работе мы определяем состав материалов клеточных стенок растений, чтобы оценить возможность преобразования этих лигнин Cellose X, которые являются высокодоступным возобновляемым ресурсом, в биотопливо.

Сегодня мы сосредоточимся на полифенольном лигнине в другом видео под названием «Комплексный композиционный анализ клеточных стенок растений, часть вторая: углеводы». Мы уделим внимание анализу полисахаридов. Для начала данной процедуры поместите три стальные шарика диаметром 5,5 мм в пробирку объемом 2 мл с завинчивающейся крышкой и примерно 60–70 mg высушенного на воздухе или лиофилизированного растительного материала.

Материал можно измельчить в мелкий порошок с помощью eyewall — робота для измельчения и дозирования. Робот eyewall захватывает пробирку и встряхивает ее в течение 30 секунд; благодаря металлическим шарикам материал перетирается в мелкий порошок, после чего плотный растительный порошок разрыхляют с помощью альтернативной неавтоматизированной процедуры с низкой пропускной способностью. Способ облегчения ретро-экстракции представлен во второй части: к измельченному материалу добавляют 1,5 M 70% водного этанола, тщательно перемешивают на вортексе и центрифугируют при комнатной температуре.

Эта обработка солюбилизирует большинство белков и клеточных органелл; аспирируйте супернатант и добавьте раствор хлороформа и метанола в соотношении один к одному по объему к осадку, нерастворимому в спирте. Тщательно перемешайте для ресуспендирования осадка и центрифугируйте. Хлороформ-метанольный раствор экстрагирует гидрофобные соединения, такие как липиды; после центрифугирования аспирируйте супернатант и ресуспендируйте осадок в 500 microliters ацетона.

Для высушивания образца выпарите растворитель струей воздуха при 35 °C до полного высыхания; высушенные образцы можно хранить при комнатной температуре до дальнейшей обработки. Для начала удаления крахмала из остатков образца суспендируйте осадок в 1,5 мл 0,1 молярного раствора ацетата натрия с pH 5, закройте пробирки крышками и нагрейте их в нагревательном блоке для клейстеризации крахмала. После охлаждения суспензии на льду добавьте смесь ферментов, разлагающих крахмал, закройте пробирку и тщательно перемешайте на вортексе; инкубируйте суспензию в течение ночи.

Для обеспечения надлежащего перемешивания используйте ротационный шейкер при 37 °C. После инкубации в течение ночи прекратите процесс расщепления, нагрев в термоблоке при 100 °C в течение 10 минут. Затем центрифугируйте пробу и удалите супернатант, содержащий растворимый крахмал.

Трижды промойте оставшийся осадок, используя по 1,5 мл воды для каждой промывки, путем перемешивания на вортексе, центрифугирования и декантации, как было продемонстрировано ранее. В завершение ресуспендируйте осадок в 500 microliters ацетона и выпарите растворитель струей воздуха при 35 °C до полного высыхания. Высушенные образцы, содержащие изолированную клеточную стенку или леги, без целлюлозы, готовы к дальнейшему анализу и могут храниться при комнатной температуре.

Начните с взвешивания от 1 до 1,5 миллиграммов подготовленного материала клеточной стенки. Материал можно взвешивать вручную или автоматизированным способом с использованием окуляра весов, как показано во второй части. Промойте стенки пробирки 250 микролитрами ацетона, чтобы собрать материал клеточной стенки на дне пробирки, и очень осторожно выпарите ацетон в потоке воздуха.

После испарения ацетона осторожно добавьте по стенкам 100 µL свежеприготовленного 25% (об./об.) раствора бромистого ацетила в ледяной уксусной кислоте. Чтобы избежать разбрызгивания, добавляйте раствор медленно; бромид расщепляет полимер лигнина до его ацетилированных мономеров. Затем закройте мерную колбу пробкой и выдержите при температуре 50 °C в течение двух часов.

Продолжайте нагрев еще один час, перемешивая содержимое каждые 15 минут, а затем охладите на льду. После охлаждения колбы при комнатной температуре добавьте 400 µL 2 M гидроксида натрия и 70 µL свежеприготовленного 0,5 M гидрохлорида гидроксиламина; перемешайте мерные колбы на вортексе. Затем нейтрализуйте раствор, долив ледяную уксусную кислоту точно до метки 2 mL мерной колбы; закройте колбу крышкой и несколько раз переверните для перемешивания. Перенесите пипеткой 200 µL раствора, содержащего гидролизованные и растворенные монолизы, в специализированный 96-луночный планшет для УФ-спектрометрии и измерьте показатели на планшетном ридере при 280 nm. Проведите считывание планшета не менее трех раз и вычислите среднее значение абсорбции, так как наличие твердых частиц может вызвать незначительные колебания значений абсорбции.

Определите процентное содержание бромид-растворимого лигнина (BSL) с использованием соответствующего коэффициента для данного растения по формуле, представленной в письменном протоколе. Лигнин представляет собой полифенольную сеть, состоящую в основном из трех субъединиц: p-гидроксифенильных, гваяциловых и сирингиловых единиц; их определение позволяет установить состав лигнина в растительном материале. Начните с переноса примерно 2 mg материала клеточных стенок в стеклянную пробирку с завинчивающейся крышкой для цитолиза.

Далее подготовьтесь к приготовлению 2,5% раствора трифторида бора этилата и 10% раствора этантиола в диоксане. Поскольку диоксан очень опасен, не выносите образцы или оборудование из вытяжного шкафа. Помните о необходимости соблюдать крайнюю осторожность и используйте баллон с азотом, чтобы заполнить объем вытесненного диоксана в бутыли азотом.

Подготовьте раствор, смешав следующие объемы на один образец: 175 µL диоксана, 20 µL ETSH и 5 µL BF3. После перемешивания добавьте по 200 µL полученного раствора в каждый образец. Продуйте верхнюю часть флакона азотом и закройте крышкой.

Сразу после этого подвергните образцы нагреву при 100 °C в течение четырех часов, осторожно перемешивая их в конце каждого часа. Прекратите реакцию лизиса, поместив пробы на лед на пять минут. Затем добавьте 150 µL 0,4 M бикарбоната натрия для нейтрализации и перемешайте на вортексе.

Для очистки продуктов распада лигнина добавьте 1 мл воды и 0,5 мл ацетата, перемешайте на вортексе и дайте фазам разделиться. Слой этилацетата будет находиться сверху, а вода — снизу. Перенесите 150 µL верхнего слоя этилацетата, содержащего компоненты лигнина, в пробирку объемом 2 мл, следя за тем, чтобы вода не попала в пробирку.

После переноса из верхнего слоя этилацетата выпарите растворитель с помощью концентратора с обдувом. Добавьте 200 µL ацетона и выпарите. Повторите обработку ацетоном дважды для удаления избытка воды.

Далее переведите компоненты лигнина в соответствующие летучие триметилсилильных производных. Добавьте в каждую пробирку 500 µL этилацетата, 20 µL пурина и 100 µL N,O-бис(триметилсилил)ацетамида. Инкубируйте в течение двух часов при 25 °C.

По истечении двух часов перенесите 100 µL реакционной смеси в виалу для ГХ-МС и добавьте 100 µL ацетона. Проанализируйте образцы с помощью ГХ, оснащенной квадрупольным масс-спектрометром или пламенно-ионизационным детектором. Параметры колонки и сведения о режиме анализа указаны в прилагаемом письменном протоколе.

Ниже представлены репрезентативные результаты анализа лигнина с использованием древесины тополя в качестве растительного материала. Согласно данному анализу, полифенольный лигнин составляет 22% материала тополя. Состав компонентов лигнина был проанализирован методом ГХ-МС.

Пики идентифицируют по относительному времени удерживания с использованием тетракозана в качестве внутреннего стандарта или по характерным ионам масс-спектра 299 m/z, 269 m/z и 239 m/z для мономеров S, H и G соответственно. Состав компонентов лигнина количественно определяют, принимая общую площадь пиков за 100%. Анализ состава показывает, что данный конкретный образец содержит преимущественно сирингильные или S-единицы. Тем не менее, гваяцильные или G-единицы также присутствуют в значительном количестве.

Очевидно, что количество и состав мономерных единиц могут варьироваться в зависимости от ткани и вида растения. Мы только что продемонстрировали вам способ определения содержания и состава лигнина в растительном материале для анализа полисахаридов. Переходите ко второй части.

Спасибо за просмотр и удачи в ваших экспериментах.