Всеобъемлющее Композиционные Анализ стен растительной клетки (лигноцеллюлозной биомассы) Часть II: Углеводы

Определение состава матричных полисахаридов и содержания кристаллической целлюлозы в клеточных стенках растений начинается с использования высушенного растительного материала, который подвергается различным видам экстракции. Полученный материал состоит исключительно из клеточных стенок, после чего его разделяют для определения состава матричных полисахаридов. Материал стенок обрабатывают слабым раствором кислоты для гидролиза некристаллических полисахаридов, которые представлены главным образом гемицеллюлозами, до их моносахаридов.

Затем моносахариды переводят в соответствующие летучие альдольные ацетаты, которые далее анализируют и количественно определяют методом газовой хроматографии с масс-спектрометрическим детектированием для определения кристаллической целлюлозы. Клеточные стенки обрабатывают реагентом Графа — смесью кислот, которые удаляют некристаллические компоненты стенки. Оставшаяся кристаллическая целлюлоза расщепляется до мономерной глюкозы, которая может быть определена колориметрически.

Определение содержания и состава лигнина демонстрируется в другом видеоиздании JoVE под названием «Комплексный анализ состава клеточных стенок растений, часть первая: лигнин». Здравствуйте, я Маркус Поли, руководитель аналитического центра по изучению клеточных стенок в Центре исследований биоэнергетики Великих озер при Университете штата Мичиган. Я Клифф Фостер, менеджер аналитического центра по изучению клеточных стенок.

Сегодня мы продемонстрируем вам способ определения состава полисахаридов, присутствующих в материале клеточной стенки растений, который представляет собой целлюлозу различных видов Homo celluloses. Здесь, в Исследовательском центре биоэнергетики Великих озер, мы разрабатываем технологии по переработке этих сахаров в биотопливо. Чтобы определить оптимальное растительное сырье, нам сначала необходимо оценить тип и количество сахаров, содержащихся в этой биомассе.

В другом видео под названием «Комплексный композиционный анализ клеточных стенок растений, часть первая: лигнин» мы сосредоточимся на анализе полифенолов. Итак, приступим. Начните выполнение данной процедуры с выделения клеточных стенок.

Разотрите примерно 60–70 миллиграммов высушенного растительного материала с помощью стальных шариков диаметром 5,5 миллиметра в пробирке с завинчивающейся крышкой SAR TED объемом 2 мл. В качестве высокопроизводительной альтернативы используйте мельницу REM и робот для измельчения и дозирования, называемый eyewall, как описано в первой части. По завершении измельчения удалите стальные шарики.

Продолжайте выделять клеточные стенки и удалять остаточный крахмал, как показано в первой части и описано в прилагаемом письменном протоколе. Отвесьте 2 mg материала клеточных стенок крахмала DS в пробирку объемом 2 мл. Высокопроизводительным способом выполнения этой задачи является использование робота eyewall.

Робот берет пробирку с измельченным растительным материалом и проделывает отверстие в ее дне. Затем проколотая пробирка помещается в податчик VI. Пустая пробирка устанавливается на весы и перемещается под податчик VI; посредством вибрации материал просачивается через отверстие в верхней заполненной пробирке в пустую нижнюю пробирку до тех пор, пока не будет накоплено необходимое количество материала.

Добавьте 100 micrograms ацетола в качестве внутреннего стандарта. Промойте стенки пробирки ацетоном, чтобы собрать материал клеточных стенок на дне пробирки, и очень осторожно выпарите ацетон в потоке воздуха. Затем проведите гидролиз слабым кислотным раствором.

Осторожно добавьте 250 µL двухмолярной трихлоруксусной кислоты или TFA в каждый образец, следя за тем, чтобы раствор не попал на стенки пробирок. Плотно закройте пробирки крышками и инкубируйте в нагревательном блоке при 121 °C в течение 90 минут. Затем охладите нагревательные блоки и образцы на льду и центрифугируйте пробирки при 10 000 RPM в течение 10 минут.

Перенесите 100 мкл кислого супернатанта, содержащего растворенные сахара матридного полисахарида, в виалы с завинчивающимися крышками, стараясь не потревожить осадок. Осадок можно использовать для анализа кристаллической целлюлозы. Испарите TFA в стеклянной пробирке под слабым потоком воздуха с помощью испарителя.

Добавьте 300 µL 2-пропанола для удаления избытка кислоты, перемешайте на вортексе и выпарите при 25 °C. Повторите процедуру в общей сложности три раза. Для обеспечения возможности идентификации моносахаридов методом газовой хроматографии проведите дериватизацию в форме алдолацетата.

Сначала восстановите моносахариды до соответствующих открытых кольцевых альдолов, которые затем ацетилируют. Подробные инструкции приведены в прилагаемом письменном протоколе. Каждый этап процедуры соответствует ранее описанному протоколу: добавление реагента, инкубация, испарение в потоке воздуха с последующим удалением избытка реагента путем проведения различных этапов промывки.

На заключительных этапах проводят экстракцию альдоль-ацетатов. Сначала добавьте 500 µL этилацетата и осторожно перемешайте круговым движением. Затем добавьте 2 мл воды, закройте пробирки крышками и перемешайте на вортексе; центрифугируйте пробирки при 2000 об/мин в течение пяти минут до получения четко разделенных слоев, где этилацетат, содержащий альдоль-ацетаты, находится сверху, а вода — снизу. Перенесите с помощью пипетки 50 µL слоя этилацетата в виалы для ГХ-МС с вкладышами; разбавьте пробу, добавив в виалу для ГХ 100 µL ацетона. Виалы для ГХ можно хранить при температуре 4 °C.

Если анализ методом ГХ-МС не проводится незамедлительно, введите образцы в газовый хроматограф, оснащенный квадрупольным масс-спектрометром. Сведения о колонке и параметрах анализа приведены в прилагаемом письменном протоколе. В качестве исходного материала для определения содержания кристаллической целлюлозы может использоваться изолированный материал клеточной стенки или материал стенки, предварительно обработанный слабым раствором TFA, либо сразу после обработки кислотой, либо в виде высушенного хранимого материала.

После удаления избытка TFA изопропанолом, как показано ранее, добавьте к осадку TFA в пробирке 1 M реагента Up-degra, состоящего из уксусной кислоты, азотной кислоты и воды, в соотношении от 8:1 до 2:1 по объему. Плотно закройте пробирку крышкой, перемешайте на вортексе и нагрейте на нагревательном блоке при 100 °C в течение 30 минут. В результате данной обработки в осадке останется только кристаллическая целлюлоза.

Все остальные полисахариды гидролизуют. Охлаждайте образцы в блоке на льду до комнатной температуры или ниже. Затем центрифугируйте образцы при 10 000 RPM в течение 15 минут. После центрифугирования слейте супернатант, стараясь не задеть осадок, чтобы избежать потери материала. Для этого оставьте в пробирке примерно 150 µL супернатанта, затем несколько раз промойте осадок водой.

Затем проведите кислотный гидролиз с использованием концентрированной серной кислоты для полного гидролиза кристаллической и целлюлозной гранул до глюкозы. Начните с добавления 175 µL 72% серной кислоты в пробирку Sarta и инкубируйте в течение 30 минут при комнатной температуре. После первоначальной инкубации перемешайте образец на вортексе и инкубируйте еще 15 минут.

Затем добавьте 825 µL воды, перемешайте на вортексе и центрифугируйте образцы при 10 000 RPM в течение пяти минут. В пробирке может остаться некоторое количество коричневого растворимого вещества, преимущественно лигнина, тогда как глюкоза будет находиться в супернатанте. Содержание глюкозы в супернатанте определяют с помощью колориметрического антронового метода.

Данный анализ проводится в 96-луночном полистироловом микропланшете. Постройте стандартную кривую глюкозы в двух повторах, следуя инструкциям в прилагаемом письменном протоколе. Подготовьте образцы, объединив 10 µL каждого образца (супернатанта) и 90 µL воды в отдельные лунки того же микропланшета, что и стандарт; завершите процедуру, добавив 200 µL свежеприготовленного рабочего реагента.

Затем нагревайте планшет в течение 30 минут при 80 °C в печи с алюминиевым распределителем тепла. Обратите внимание, что после завершения нагрева образцы, содержащие глюкозу, из желтых становятся сине-зелеными. Дайте планшету остыть до комнатной температуры и тщательно перемешайте содержимое.

Измерьте абсорбцию при 625 нанометрах с помощью планшетного ридера. Содержание глюкозы, основного строительного блока целлюлозы, рассчитывается на основании значения абсорбции по сравнению со стандартной кривой, построенной на той же планшете. Ниже приведены репрезентативные результаты анализа полисахаридов образца древесины тополя.

Пики газовой хроматограммы идентифицируются по масс-спектрам и/или временам удерживания стандартов. Количество моносахаридов определяется на основании стандартных кривых. Анализ состава сахаров полисахаридов матрицы показывает высокое содержание ксилозы, что характерно для гемицеллюлозы, однако присутствуют и другие сахара.

Согласно результатам анализа, 40% материала тополя состоит из кристаллической целлюлозы и целлюлозы. Обратите внимание, что данные показатели и состав могут варьироваться от растения к растению или между различными анатомическими структурами растений. Мы продемонстрировали вам способ определения содержания полисахаридов и проведения компонентного анализа лигноцеллюлозной биомассы для анализа полифенольного лигнина.

Переходите к первой части. Спасибо за просмотр и удачи в ваших экспериментах.