Важность правильной концентрации белка для кинетики и Affinity Определение в структурно-функционального анализа

Общая цель данной видеостатьи — дать ответы на следующие два вопроса. Во-первых, можно ли повысить достоверность исследований белковых взаимодействий, измеряя долю белкового образца, которая фактически способна связываться с другим белком? Во-вторых, как кинетический анализ может помочь нам лучше понять взаимосвязь между структурой и функцией?

Оба этих вопроса будут рассмотрены в эксперименте с использованием Corp X 100 — прибора, который позволяет обнаруживать белковые взаимодействия в режиме реального времени без применения меток. В данном эксперименте будет изучено взаимодействие бычьего цистатина B с цистеиновой протеазой папаином; кристаллическая структура комплекса этих двух белков указывает на несколько остатков, участвующих в связывании с протеазой, что позволит определить, как каждый из взаимодействующих остатков влияет на взаимодействие цистатина B с папаином. С помощью сайт-направленного мутагенеза будет получено несколько вариантов цистатина B.

В подобных экспериментах всегда существует вероятность того, что рекомбинантные белки свернутся неправильно, агрегируют или подвергнутся деградации, что приведет к ошибочным и невоспроизводимым результатам. Система VIACORE X 100 позволяет определять долю белка, доступного для связывания, с помощью анализа концентрации без калибровки, сокращенно CFCA. Данный подход позволяет определять концентрацию белка с сохраненной способностью к связыванию даже при отсутствии калибровочных стандартов.

Метод CFCA будет использован для определения концентрации вариантов цистатина B. Эти данные затем будут использованы в качестве входных параметров при определении кинетики связывания вариантов цистатина B с Pepin, которая также оценивается с помощью BOR X 100. Здравствуйте, я КЛА Грам из GE Healthcare, Швеция.

Сегодня моя коллега Ева Пул покажет вам, как проводить анализ зависимости структуры от функции с помощью BOR X 100. Рекомбинантные белки могут иметь неправильную укладку или терять активность со временем, и такое поведение невозможно обнаружить методами, основанными на измерении общей концентрации. Это может, в свою очередь, привести к получению некорректных кинетических данных после измерения концентрации с помощью анализа концентрации без калибровки. B.A core X 100 используется для анализа кинетики и аффинности взаимодействия вариантов цистатина B с пепсином.

Эти параметры позволят понять механизм связывания. Мы начнем с краткого описания плана эксперимента, так что приступим. Взаимодействие между цистеиновой протеазой папаином и ингибитором цистатином B характеризуется преобладанием гидрофобных контактов, что подтверждается кристаллической структурой комплекса этих двух белков.

Со стороны ингибитора областями контакта являются N- и C-концевые участки, а также две шпилечные петли. В данном исследовании изучены четыре мутанта, в каждом из которых была введена мутация цистеина, чтобы предотвратить димеризацию цистатина B. Исходя из контекста, выявленного в структуре кристалла, лейцин 73 был заменен на глицин, гистидин 75 — на глицин, а тирозин 97 был заменен на аланин. Две мутации с заменой на глицин были введены для изучения значимости боковых цепей гистидина 75 и лейцина 73 для связывания с пепсином, а остаток тирозина был заменен на аланин для исследования взаимодействия между C-концом цистатина B и пепсином.

Три двойных мутанта, а также три одиночных мутанта сирийского типа (INE three to Syrian single mutant), тестируют на предмет взаимодействия с каталитически неактивным вариантом папаина S-метилпапаином. Эта каталитически неактивная форма протеазы имеет метильную группу, присоединенную к CYS 25 в активном центре. Для простоты в данном протоколе мы будем называть этот вариант пропаином.

Метод CFCA основан на измерении скорости связывания в условиях, когда эта скорость ограничена диффузией молекул аналита к поверхности. Этому способствуют высокие уровни иммобилизации лиганда. Перед началом процедуры иммобилизации поместите буфер HEPs, используемый в экспериментах, на левый лоток и вставьте обе трубки.

Также поместите пустую бутыль для отходов на правый лоток. Затем вставьте новый сенсор gypsum five в прибор, инициализируйте его с помощью программного обеспечения core X 100 и на начальном экране выберите пункт dock chip tool. В программном обеспечении нажмите кнопку start doc.

Затем используйте мастер иммобилизации для настройки подготовки и иммобилизации, выбрав «coupling to sensor CM5» на начальном экране; нажмите кнопку «Other options», затем выберите «Wizards». Откроется окно с доступными мастерами. Выберите «Immobilization» и нажмите кнопку «New» в нижнем правом углу. Появится первый экран мастера иммобилизации, где по умолчанию будет выбрано «coupling to sensor CM5».

Отметьте флажком пункт под проточной кюветой два, чтобы выполнить иммобилизацию во второй проточной кювете. Первая проточная кювета остается немодифицированной, чтобы использовать ее в качестве опорной поверхности (из трех доступных вариантов ниже). Отметьте флажком «specify contact time» (указать время контакта), после чего правое поле уровня цели изменится на время контакта; укажите время контакта 900 seconds.

Далее введите параметры иммобилизации в поле «захватывающая молекула / раствор лиганда» (capturing molecule / ligand solution). Введите papain. Затем нажмите «далее» (next).

На следующем экране отображается схема расположения штатива для образцов. В позиции один будет находиться этаноламин, используемый для деактивации оставшихся активных групп после прикрепления лиганда папаина к поверхности чипа. Поместите раствор этаноламина в позицию один и позицию два.

Приготовьте лиганд папаин; папаин хранится с избытком метилсульфата и разводится до концентрации 50 µg/mL в 10 mM натрий-ацетатном буфере (pH 4.5). Растворите реагенты для сшивки EDC и NHS из набора для аминного связывания двойной дистиллированной водой. Перенесите пипеткой 85 µL EDC в пробирку, закройте ее крышкой и поместите в позицию три.

Используйте такой же объем NHS в четвертой позиции. Обратите внимание, что пробирка пять должна быть закрыта крышкой и пуста, чтобы прибор мог смешать ED, C и NHS в этой пробирке. Также не забудьте наполнить промывочную пробирку в позиции H2O свежей деионизированной водой.

Когда штатив будет заполнен в соответствии со схемой на экране, нажмите «load samples» (загрузить образцы) и установите штатив в прибор. После установки штатива нажмите «next» (далее). Перед началом запуска будет отображен контрольный список.

Убедитесь, что все пункты списка выполнены. Запуск осуществляется путем нажатия кнопки старта. Запуск производится во время процедуры иммобилизации.

Данные собираются в режиме реальногого времени. Сначала вводят реагенты для сшивки. Затем папе связывают с поверхностью чипа, и процедура завершается деактивацией оставшихся активных эфиров.

По завершении запуска в диалоговом окне отобразится сводка результатов. В этом окне будет указан уровень иммобилизации. В результате всей процедуры сочетания должно быть иммобилизовано около 3000 RU папаина.

После иммобилизации папаина на сенсорном чипе начните анализ CFCA, разбавив образцы мутантного цистатина B до общей концентрации около 10 nM в объеме не менее 300 µL. Запишите коэффициент разведения, так как он понадобится позже при настройке анализа. Для начала откройте диалоговое окно мастера, как описано в предыдущем разделе в подразделе концентрации папки анализа.

Выберите «calibration free», затем выберите «new». На первом экране мастера отображается последовательность инъекций. Настройки можно оставить без изменений, так как здесь используются сенсорный чип CM5 и метод прямого иммобилизационного анализа.

На следующем экране нажмите «Next». Оставьте отмеченными флажки «Prime before run» и «Run startup cycles». Также оставьте количество подготовительных циклов (startup cycles) по умолчанию — три.

Введите heaps buffer в поле с названием раствора. Затем нажмите «Далее». На следующем экране введите название регенерирующего раствора, которым является 20 millimolar sodium hydroxide.

Оставьте остальные параметры без изменений. Нажмите «Далее», чтобы просмотреть таблицу образцов. Подготовьте образцы в соответствии с этой таблицей.

Каждой строке в таблице образцов соответствуют два цикла: один со скоростью потока 10 µL/min и один со скоростью 100 µL/min. Начните запуск с холостого пробы.

Затем введите название, коэффициент разбавления, коэффициент диффузии при 20 °C и молекулярную массу. Для каждого мутанта коэффициент диффузии можно рассчитать с помощью веб-инструмента на сайте производителя. Ссылка на этот инструмент представлена в навигаторе поддержки программного обеспечения.

Поскольку рекомендуется анализировать каждый образец в дублях, скопируйте всю таблицу от пустой строки до последнего образца и вставьте ее в нижней части таблицы. Нажмите «Далее», чтобы продолжить. На следующем экране будет отображен штатив для образцов.

Разместите образцы и реагенты в штативе в соответствии со схемой, указанной в программном обеспечении. Загрузите штатив в прибор, нажав кнопку загрузки образцов (load samples). Затем нажмите «Далее» (next).

После загрузки образцов на экране появится напоминание со списком необходимых проверок. Убедитесь, что все пункты выполнены, после чего нажмите кнопку запуска. Сбор данных осуществляется в режиме реального времени в ходе анализа.

По завершении анализа закройте окно с собранными данными. Обратите внимание, что в главном окне появился новый пункт с результатами. Чтобы рассчитать концентрации на основе полученных данных, выберите этот новый пункт и нажмите кнопку.

Проведите оценку с помощью core X 100. Запустите программу для анализа, чтобы отобразить все собранные данные; на панели инструментов выберите «concentration analysis» (анализ концентрации), а затем в меню — «calibration free» (без калибровки). В первом окне выберите данные, которые будут включены в анализ.

Прокрутите список и переходите по списку просмотров, чтобы просмотреть данные для всех образцов. Если вы хотите исключить какие-либо данные, снимите галочку в списке. Нажмите «Next», чтобы начать расчет.

Модель взаимодействия CFCA автоматически аппроксимируется по экспериментальным данным; по завершении подбора параметров результаты для каждого образца выводятся в окне результатов. Просмотрите результаты аппроксимации для каждого образца, выбирая соответствующую строку в таблице. В столбце «measured concentration» (измеренная концентрация) указана концентрация в анализируемом образце.

Концентрация в исходном образце рассчитывается с использованием введенного ранее коэффициента разбавления и отображается в колонке «calculated concentration»; по завершении нажмите «finish», чтобы сохранить результат. Теперь, когда нам известны концентрации белков по результатам анализа CFCA, у нас есть отличная основа для последующих кинетических измерений. Кинетический анализ поможет нам понять значимость ключевых аминокислотных остатков для механизма связывания.

Приступим к настройке кинетического анализа. Кинетический анализ начинается с установки нового сенсорного чипа CM5 в прибор на начальном экране. Выберите создание рабочего процесса анализа для определения кинетики аффинности.

В верхнем левом углу появляется диалоговое окно, в которое вводится информация о лиганде. Введите название papain в поле имени лиганда и выберите соответствующий белок из списка видов. Затем из двух представленных альтернативных способов закрепления лиганда выберите immobilize ligand covalently using sensor chip CM five; теперь в правой части окна отображается рекомендуемый рабочий процесс анализа.

Процесс начинается с этапа иммобилизации, за которым следует этап анализа. Нажмите «Продолжить», чтобы перейти далее. Сохраните рабочий процесс анализа, введя название и нажав «Сохранить».

Теперь программное обеспечение отображает рабочий процесс анализа с кнопками, соответствующими каждому этапу. Первым шагом в подготовке поверхности сенсора является поиск pH мобилизации. Поскольку это значение pH известно, нажмите «ввести известное значение» (enter known value) в появившемся диалоговом окне.

Введите название буфера «ацетат» и значение pH 4.5, затем выберите «сохранить» (save). Рабочий процесс анализа будет обновлен зеленой галочкой, указывающей на завершение этого этапа. Теперь необходимо перейти к иммобилизации: нажмите кнопку запуска (run) на этапе иммобилизации.

Здесь открывается тот же мастер, который использовался для пропана и иммобилизации при анализе CFCA. Иммобилизация папина для кинетического анализа настраивается аналогичным образом, за исключением того, что вводится более разбавленный раствор в течение меньшего времени. Это делается для того, чтобы иммобилизовать меньшее количество папина и избежать ситуаций, когда скорость связывания мутантов цистатина ограничена диффузией, что позволит измерить кинетические данные изолированно. Поскольку название лиганда и pH иммобилизации были введены на предыдущих этапах рабочего процесса анализа, эти параметры здесь установлены по умолчанию.

Единственным необходимым изменением является установка времени контакта на 50 seconds. Затем иммобилизация проводится так же, как было показано ранее. Ожидаемый уровень связывания после иммобилизации составляет 50 R ru.

Зеленая галочка рядом с кнопкой запуска указывает на завершение иммобилизации. Далее введите регенерационный раствор в рабочем процессе на соответствующем этапе. Найдите условия регенерации, нажав «ввести известные значения» (enter known values) в появившемся диалоговом окне.

Введите состав регенерирующего раствора и время контакта. Затем нажмите кнопку «Сохранить». Теперь, когда лиганд иммобилизован, а условия регенерации заданы, всё готово для получения кинетических данных: в окне «Run kinetics Affinity assay» нажмите кнопку запуска, чтобы начать первый этап анализа кинетики.

Мастер по подбору сродства (Affinity wizard) описывает последовательность инъекций для каждого цикла при определении кинетики за один цикл, что и используется в данном случае, поэтому вносить изменения не требуется. Нажмите «Далее» (next) для продолжения. На следующем шаге оставьте настройки по умолчанию, указывающие на необходимость подготовки системы (прайминга) перед запуском.

Выберите выполнение одного пускового цикла для уравновешивания поверхности чипа. Затем определите параметры инъекции образца. Поскольку раствор для регенерации был указан ранее и настройка предопределена, изменять параметры на экране не требуется.

Нажмите «Далее». Наконец, укажите образцы. Введите по две строки для каждого варианта мутанта: одну пустую и одну с образцом.

Холостой цикл задается установкой параметра максимальной концентрации на ноль. За один запуск можно определить два варианта цистатина B. Для каждого мутанта введите молекулярную массу, максимальную концентрацию и коэффициент разведения, затем нажмите «Next».

На следующем экране выделен штатив для образцов. Подготовьте серию разведений образцов белка и поместите флаконы с крышками в штатив. Как показано на экране, во флакон в позиции 13 помещается буфер, а во флакон в позиции 14 — регенерационный раствор. Убедитесь, что позиция для воды заполнена свежей водой.

Поместите штатив в прибор и загрузите образцы, нажав кнопку «load samples», затем нажмите «next». Как и прежде, проведите финальную проверку перед запуском эксперимента, нажав «start»; данные взаимодействия будут отображаться в режиме реального времени. По завершении запуска немедленно перейдите к анализу остальных вариантов цистатина B, следуя только что продемонстрированной процедуре.

Если оставшиеся варианты цистатина B запускаются последовательно, пропустите этап прайминга и цикл запуска, сняв соответствующие флажки в шаге. По завершении каждого запуска доступ к данным можно получить по ссылке. Все результаты находятся в рабочем процессе анализа.

Появится диалоговое окно со всеми результатами, полученными в рамках данного рабочего процесса. Чтобы рассчитать константы кинетических скоростей, выберите результат для анализа и нажмите evaluate; запустится программное обеспечение core X 100 evaluation, отображающее все собранные данные. Выберите kinetics affinity в меню панели инструментов.

На первом экране для оценки выбирается мутант Cys3S. Данные по этому мутанту отображаются вместе с результатом холостого опыта, проведенного для данного мутанта; чтобы продолжить, нажмите «Next». На следующем экране отображаются данные, из которых результат холостого опыта вычтен из данных опыта с образцом.

Выберите оценку кинетики, нажав кнопку kinetics. Затем выберите аппроксимацию данных по модели взаимодействия один к одному. После нажатия кнопки fit процесс аппроксимации будет отображаться на экране по мере выполнения расчетов.

После завершения обработки автоматически применяются элементы контроля качества, которые выделяются в нижней части экрана. Ознакомьтесь с параметрами контроля качества, а затем изучите данные сенсограммы, чтобы убедиться, что кривые имеют достаточный изгиб. Также просмотрите график остатков, отображающий разницу между собранными данными и подобранной моделью.

Обратите внимание на систематические и неслучайные отклонения. Данное согласование является приемлемым. Теперь изучите кинетические данные на вкладке отчета.

Константа скорости ассоциации, константа скорости диссоциации и равновесная константа диссоциации. По завершении нажмите «Finish» и повторите ту же процедуру для всех остальных мутантов. Ниже представлены репрезентативные результаты анализа CFCA для различных исследованных вариантов цистатина B.

Данные о концентрации специфического связывания извлекаются из сеннограмм, полученных при скоростях потока 10 и 100 µL в минуту. При сравнении концентрации, определенной методом двухкратного измерения 80, с концентрацией, определенной с помощью CFCA, становится очевидно, что хотя в большинстве случаев белок полностью активен для варианта leucine 73 glycine, доля активного белка очень мала. Кинетика связывания вариантов цистатина B с пепсином определяется с использованием одноцикловой кинетики.

На сенсограммах представлены данные за вычетом холостого и референсного сигналов, на которые черным цветом наложена кинетическая кривая для модели взаимодействия один к одному. Концентрация специфического связывания, измеренная методом CFCA для варианта лейцина 73, составляет всего около 10% от общей концентрации белка, определенной с помощью измерения 2-80. При использовании правильной концентрации для расчета кинетических параметров становится очевидно, что скорость ассоциации для лейцина 73 схожа со скоростью других вариантов.

В то время как константы ассоциации мутантных форм сопоставимы с константой белка дикого типа, константа скорости диссоциации мутантов может быть выше почти на два порядка, что сопровождается соответствующим увеличением равновесной константы диссоциации. Снижение сродства обусловлено главным образом увеличением скорости диссоциации; это указывает на то, что и вторая связывающая петля, и C-концевой участок цистатина B способствуют сродству к связыванию, удерживая ингибитор в связи с ферментом после формирования комплекса. Использование анализа концентрации без калибровки было крайне важным для этого вывода, так как один из мутантов оказался обладающим очень низкой связывающей активностью. Мой коллега Пол продемонстрировал вам, как использовать BiCore X 100 в структурированном функциональном исследовании. При проведении этих экспериментов важно помнить, что, хотя и анализ концентрации, и кинетический анализ основаны на одной и той же процедуре связывания, экспериментальные условия существенно различаются.