Анализ Большие белковые комплексы структурных масс-спектрометрии

Общая цель следующего эксперимента заключается в характеристике крупных белковых комплексов с помощью структурной масс-спектрометрии. Это достигается путем подготовки капилляров с золотым покрытием для нанопотоковой электрораспылительной ионизации. На втором этапе подготавливается образец и выполняется калибровка масс-спектрометра для измерений большой массы.

Затем проводится оптимизация условий эксперимента для сохранения целостности белковых комплексов в газовой фазе. После этого регистрируются масс-спектры (МС) и тандемные масс-спектры. МС-спектры продемонстрировали состояния заряда, соответствующие по массе интактному комплексу, в то время как эксперименты по тандемной МС выявили схему ассоциации мономеров и частично диссоциировавших комплексов.

Здравствуйте, я Наам Киба из лаборатории Мирона в Институте науки Уайтмена, а я — Исаак Ки, также из лаборатории Мирона. Сегодня мы хотели бы продемонстрировать вам базовую процедуру анализа крупных белковых комплексов с помощью структурной спектрометрии. Мы используем этот метод в нашей лаборатории для характеристики белковых комплексов, чтобы определить их общую геометрию, состав и сети взаимодействий. Итак, приступим.

Анализ нековалентных белковых комплексов проводится методом иммунизации с помощью воздушного распыления с использованием капилляров As Me Plus или A Qua. Такие капилляры могут быть вытянуты до получения тонкого кончика диаметром около 1 микрона, после чего они покрываются проводящим материалом, например золотом. Эти капилляры доступны в коммерческой продаже, как показано здесь.

Однако такой метод гораздо более экономичен в использовании. Стеклянные капилляры, которые затем охлаждают и покрывают до состояния готовности к использованию, охлаждаются на этом устройстве для охлаждения игл, а покрытие наносится на этом устройстве для покрытия. Чтобы начать процедуру, прикрепите две полоски двустороннего адгезивного пластыря к дну чашки Петри, соблюдая расстояние 2 cm между полосками.

Поместите стеклянный стержень в центр одной из площадок. Адгезивная площадка фиксирует капилляры, а стеклянный стержень служит опорой для подготовленных капилляров и предотвращает повреждение их кончиков. Использовались боросиликатные стеклянные капилляры с внешним диаметром 1 mm и внутренним диаметром 0.78 mm.

Вставьте один капилляр в иглу, осторожно зафиксируйте его зажимами и отрегулируйте положение так, чтобы он находился в центре нагревательной нити. Осторожно затяните зажимы, пока капилляры не будут надежно закреплены с обоих концов. Вытяните капилляр, используя предопределенную программу, показанную здесь.

Однако помните, что процесс программирования вытягивателя основан на методе проб и ошибок. До получения приемлемой формы кончика каждый процесс вытягивания приводит к образованию двух готовых капилляров. Извлеките вытянутые капилляры из прибора и осмотрите их кончики, отбрасывая все деформированные или сломанные экземпляры.

С помощью тупоконечного позиционирующего пинцета поместите капилляры в чашку Петри. Основание капилляров закрепите на клейкой подушечке, а верхнюю часть прислоните к стеклянному стержню так, чтобы концы были направлены вверх. Продолжайте выкладывать капилляры, пока чашка Петри не будет заполнена.

В чашку диаметром 10 сантиметров помещается около 80 капилляров. Затем покройте капилляры золотом. Поместите планшет в установку для распыления золота.

Убедитесь, что подача газа выбрана в соответствии с инструкциями производителя, и запустите заданный цикл покрытия. Покрытие повторяют от трех до шести раз, пока капилляры не приобретут равномерный золотистый цвет. После подготовки капилляров перейдите к калибровке масс-спектрометра.

Большинство экспериментов с комплексами MultiPro проводится с помощью масс-спектрометра с электрораспылением, квадруполем и времяпролетным анализатором, такого как этот. Ввод образца осуществляется через систему Waters, модифицированную для работы с большими массами. Перед загрузкой белкового образца откалибруйте масс-спектрометр, используя иодид цезия.

Сначала приготовьте раствор цезия в очищенной воде с концентрацией 100 mg/mL. Цезий используется для калибровки по высоким массам, так как однозарядные кластеры соли охватывают широкий диапазон масс: от отношения массы к заряду 393 до значений значительно превышающих 10 000. Используя тупые пинцеты, возьмите из чашки Петри покрытый капилляр и внесите в него 2 µL раствора цезия.

Используйте наконечник, заполненный гелем einor. Переместите раствор к кончику капилляра вручную или с помощью адаптера для центрифугирования. Вставьте капилляр в держатель и отрегулируйте его положение так, чтобы кончик находился примерно в 10 миллиметрах от края держателя.

Поместите капилляр под оптический микроскоп и с помощью острых пинцетов типа AA подрежьте кончик. Важно убедиться в отсутствии в капилляре пузырьков воздуха, которые могли бы заблокировать поток, а также в том, что капилляр не засорен. Кроме того, убедитесь, что золотое покрытие капилляра не повреждено.

Если это так, замените капилляр или обрежьте кончик, чтобы удалить непокрытый участок. Затем подсоедините держатель капилляра к интерфейсу нанопотокового ESI. Поверните предметный столик XY, Z назад, чтобы избежать повреждения капилляра, и переместите столик в активированное положение.

Капилляр следует расположить на расстоянии от 1 до 10 мм от отверстия конуса. Подавайте напряжение на капилляр и низкое давление нанопотока до начала распыления. Затем постарайтесь снизить давление нанопотока до минимального значения.

Оптимизируйте интенсивность сигнала, регулируя положение предметного столика XYZ, напряжение на капилляре, давление нанопотока и поток газа десольватации. Для детектирования широкого диапазона масс серий пиков сезонов следует оптимизировать ускоряющие напряжения. В данной работе использовались следующие параметры: напряжение на капилляре от 1.3 до 1.7 kilovolts, напряжение на конусе образца от 80 до 150 volts, напряжение на экстракционном конусе от one до three volts для оптимизации пропускания высокомассных ионов, требующих мягких условий десольватации.

На начальном этапе создания вакуума между источником и анализатором фоновое давление повышают до 5–6 мбар. Для повышения фонового давления осторожно уменьшите проводимость вакуумной линии источника к спиральному насосу, частично закрывая изолирующий клапан и контролируя влияние этого действия на интенсивность сигнала. После завершения настройки масс-спектрометров зарегистрируйте около 30 сканирований со скоростью одно сканирование в секунду в диапазоне отношения массы к заряду от 1000 до 15 000; после сбора данных откалибруйте время пролета, используя соответствующую калибровочную таблицу.

После завершения калибровки можно приступать к нанесению образца белка. Образец подготавливают перед калибровкой масс-спектрометра; требуются низкие микромолярные концентрации. При необходимости сконцентрируйте образец с помощью устройств для центрифужного ультрафильтрования.

Перед использованием убедитесь, что белковый комплекс не адсорбируется на мембране устройства. Поскольку для контроля объема и УФ-поглощения могут использоваться только летучие растворы, для NESI часто требуется замена буфера. Для удаления всех следов солей, молекул буфера или любых других нелетучих аддуктов можно использовать микроцентрифужную колонку для гель-фильтрации.

Вместо этого суспендируйте образец в водном растворе ацетата аммония. Этот критический этап определяет качество спектров.

Повторяйте замену буфера до трех раз с минимальным разведением (менее чем в 1,3 раза на одно устройство), пока не будет достигнута максимальная степень обмена. Если требуется одновременно изменить концентрацию и заменить буфер, эти операции можно выполнять совместно с помощью центрифужного ультрафильтрационного метода, как было показано в начале данного раздела. Затем загрузите образец, как показано для калибровки иодидом цезия, и запустите распыление.

Начните с первоначальной оптимизации распыления до обнаружения сигнала. Используйте приведенное уравнение для среднего состояния заряда, в котором M — масса комплекса. Однако точное положение состояний заряда в дальтонах зависит от конкретного белка.

Чтобы предотвратить диссоциацию комплекса, не нагревайте источник железа. Либо выключите нагреватель, либо поддерживайте температуру ниже 40 °C. Подберите оптимальное положение капилляра, а также напряжения на конусе забора проб и экстракторе.

Для максимизации передачи ионов железа возможной отправной точкой будут следующие параметры: напряжение конуса — 100 В, напряжение экстрактора — 1 В, и напряжение капилляра — 1,5 кВ. Проверьте resulting изменения в спектрах. Оптимизируйте эти параметры в сочетании с давлением нанопотока, чтобы улучшить десольватацию и удалить остатки воды и компонентов буфера.

Увеличьте смещающее напряжение и давление газа в столкновительной ячейке. Типичные значения смещающего напряжения находятся в диапазоне от 10 до 100 вольт при потоке газа в ловушке от 1 до 10 миллилитров в минуту. Выполняйте эту процедуру осторожно, чтобы предотвратить ассоциацию комплекса, и отрегулируйте энергию столкновений в ловушке и при переносе.

Для передачи ионов с большой массой часто требуются более высокие напряжения, обычно в диапазоне от 10 до 30 вольт. На этом этапе важно избегать коллизионной диссоциации комплекса, как показано здесь. После достижения стабильного сигнала рекомендуется снизить давление нанопотока и напряжение на капилляре до минимальных значений при сохранении стабильного распыления.

После получения нескольких сканов приступайте к идентификации компонентов комплекса с помощью тандемной масс-спектрометрии. После получения оптимального и стабильного сигнала для белкового комплекса выберите ион-предшественник, установив центр массы в пределах ширины изоляции. Как правило, при низком разрешении по массе 12 и высоком разрешении от 13 до 15 используется широкий диапазон масс для обнаружения продуктов диссоциации с большой массой и низким зарядом, который затем сужается до необходимых значений для проведения МС.

Масс-спектрометрия (МС) вызывает диссоциацию предшественника железа. Повышая энергию соударений (CE) и давление в камере соударений, постепенно увеличивайте CE ловушки или переноса с шагом 10–20 В и поднимите давление газа соударений до 0–5 мл/мин. Отслеживайте изменения в спектрах до достижения оптимальных условий активации. Высокая энергия активации может вызвать диссоциацию одного или нескольких субъединиц из интактного комплекса и прояснить сродство взаимодействия различных субъединиц.

Выберите более одного заряда для анализа мс MS. В случае перекрытия компонентов получение набора тандемных MS-спектров помогает разрешить серии зарядов различных популяций. Кроме того, состояния с более высоким зарядом диссоциируют легче по сравнению с состояниями с более низким зарядом; наложите друг на друга спектры MS и мс.

Масс-спектры для подтверждения изоляции выбранного иона-предшественника. Помимо характеристики интактного комплекса с помощью MS и ms/ms, при мягких денатурирующих условиях в растворе образуются более мелкие субкомплексы, которые также подлежат характеристике.

Масс-спектрометрический анализ (МС) и тандемный масс-спектрометрический анализ (МС/МС) субкомплексов служат основой для определения субъединичной архитектуры комплекса. Для частичного нарушения взаимодействий между субъединицами постепенно добавляют органические растворители до концентрации 50% или изменяют pH раствора, добавляя аммиак или муравьиную кислоту до концентрации 4%. Наконец, для определения масс отдельных субъединиц, составляющих комплекс, важно получить спектр в денатурирующих условиях. Это можно осуществить с использованием ZipTip C4 при соотношении вода/ацетонитрил от 25 до 75 с добавлением 1% муравьиной кислоты в качестве элюирующего растворителя. Все собранные данные обрабатывают и анализируют в соответствии с подробным описанием в прилагаемом письменном протоколе. Перед вводом образца белкового комплекса масс-спектрометры калибруют с использованием иодида цезия.

Серия равноудаленных пиков, отмеченных красным, охватывает широкий диапазон от основного отношения заряда 393 до значений, значительно превышающих 10 000. Им соответствуют однозарядные сольватные кластеры общего состава комплекса цезия plus. Дополнительные сигналы между основными пиками, отмеченные черным, вызваны двух- и трехзарядными частицами серий комплекса цезия two plus и комплекса цезия three plus.

Повышение давления на начальном этапе вакуумирования необходимо для детектирования кластеров с большой массой. Влияние давления на пики с большой массой продемонстрировано здесь при значениях давления 1,2 и 5,3 millibar. Масс-спектр для более высокого давления представлен здесь в увеличенном виде.

Ниже представлен пример масс-спектрометра анализа комплекса варианта лектина, при котором распределение зарядовых состояний находится в диапазоне от 3000 до 5 000 m/z. Однако из-за недостаточной десольватации ионов пики оказываются широкими. Увеличение смещающего напряжения с 4 В до 15 В, что приводит к усилению условий ускорения, вызывает удаление остаточной воды и компонентов буфера, в результате чего получается спектр с высоким разрешением; измеренная масса соответствует пентамерному комплексу.

Для последующего тандемного МС-анализа было выбрано состояние с зарядом +15. Увеличение энергии столкновения приводит к высвобождению высокозаряженного мономера с центром при отношении массы к заряду 1 664 и лишенного лигандов тетрамерного комплекса в диапазоне от 5 000 до 8 000 по отношению массы к заряду. Вариант комплекса лектина также изучали в денатурирующих условиях, что привело к ассоциации комплексов.

Таким образом, можно определить точную массу отдельных субъединиц, составляющих комплекс. Мы только что продемонстрировали вам способ получения масс-спектров и тандемных масс-спектров ионов с большой массой. При выполнении данной процедуры важно правильно подготовить образец и использовать только летучие буферы, совместимые с масс-спектрометрией.

На этом всё. Благодарим за просмотр и желаем удачи в ваших экспериментах.