Микрожидкостных Устройство для Количественная Бактериальные Хемотаксис в стабильных градиента концентрации

Штамм E Coli RP 4 37 вводят в устройство для изучения хемотаксиса, где клетки подвергаются воздействию заданных пространственных градиентов концентрации. При попадании в камеру клетки оказываются в средней точке градиента концентрации. В зависимости от того, воспринимается ли сигнал как аттрактант или репеллент, бактерии быстро перемещаются либо вверх, либо вниз по градиенту концентрации.

Здравствуйте, я Дерек Энглер из Лаборатории биотехнологии молекулярных систем и кафедры химического машиностроения Техасского университета A&M. Сегодня мы продемонстрируем процедуру исследования бактериального хемотаксиса в микрофлюидном устройстве. В наших лабораториях мы используем этот метод для изучения миграции E. coli RP437 в градиенте концентрации сульфата никеля.

Итак, приступим. Жидкостный слой и управляющий слой изготавливаются методом репликационного формования полиметилсубоксана или PDMS с использованием мастер-шаблона из SU-8. Для начала этой процедуры смешайте преполимер PDMS и сшивающий агент в массовом соотношении 10:1.

Дегазируйте смесь в эксикаторе в течение одного часа до полного удаления пузырьков воздуха. Когда смесь PDMS будет готова, поместите мастер-форму SU-8 в чашку Петри и осторожно залейте смесь поверх мастер-формы SU-8 до достижения нужной толщины. Нагревайте чашку Петри с PDMS и мастер-формой SU-8 при температуре 80 °C в течение двух часов для полимеризации PDMS.

Через два часа снимите с нагревательного стола форму из отвержденного ПДМС, наложенную на мастер-матрицу из SU-8, и отделите ПДМС-молд от этой матрицы. Желаемая структура окажется внедренной в ПДМС-молд; с помощью тупоконечной иглы 20-го калибра проколите в ПДМС-молде четыре отверстия для трубок, ведущих к генератору градиента, входу и выходу для клеток. Теперь можно приступить к сборке ПДМС-устройства для его последующего склеивания.

Сначала очистите стеклянный предметное стекло изопропанолом и проверьте его с помощью Airstream. Затем подвергните форму из PDMS и предметное стекло воздействию кислородной плазмы в установке для плазменного травления в течение примерно 30 секунд. Приложите форму из PDMS к предметному стеклу. Нагревайте соединенные стекло и форму из PDMS на нагревательном столике при температуре 65 °C в течение 15 минут.

Для сборки устройства из PDMS используйте лезвие бритвы, чтобы отрезать трубку под углом 45 градусов до длины, необходимой в зависимости от конфигурации микроскопа. Затем с помощью пинцета вставьте один конец трубки в одно из четырех отверстий, пробитых в устройстве.

Вставьте тупой канюлевой наконечник иглы 30G в другой конец трубки. Повторите установку трубки и наконечника иглы для всех остальных отверстий. Наберите один миллилитр chemo taxes, буфера или CB в шприц объемом три миллилитра.

Следите за тем, чтобы в шприце не было воздуха. С помощью пипетки добавьте CB в основание выпускной иглы, после чего постучите по основанию иглы, чтобы удалить пузырьки воздуха. Слегка выдавите CB из кончика трехмиллилитрового шприца и соедините шприц с основанием иглы, не допуская попадания воздуха.

Прокачайте CB через устройство до тех пор, пока все оставшиеся ступицы игл не будут заполнены CB. Это позволит удалить большую часть пузырьков воздуха. Затем наполните два шприца объемом 500 µL CB, содержащим соответствующие концентрации тестируемого химического эффектора.

Чтобы избежать образования пузырьков воздуха, выдавите небольшую каплю содержимого шприца, убедитесь, что жидкость достигла основания иглы, и закрепите шприц для подготовки высокоподвижных бактерий. Для эксперимента по хемотаксису вырастите ночную культуру e coli RP 4 37 с плазмидой, экспрессирующей GFP, в триптон-бульоне или среде TB при 32 °C с перемешиванием. На следующий день используйте ночную культуру для инокуляции 20 мл среды TB в колбе Эрленмейера объемом 250 мл до достижения оптической плотности при 600 нм примерно 0,05.

Культивируйте клетки при 32 °C с перемешиванием до достижения OD 600 примерно 0,35–0,45. Соберьте клетки путем центрифугирования на низкой скорости и ресуспендируйте их до OD 600 около 0,35 в среде CB, содержащей хемоэффектор в концентрации, ожидаемой в центре канала. В завершение добавьте RFP-меченые мертвые клетки с OD 600 около 0,35 к живым клеткам, экспрессирующим GFP.

Эти погибшие клетки будут служить внутренним контролем, чтобы убедиться, что любая миграция не является следствием эффектов потока. Теперь суспензия клеток готова к загрузке в микрофлюидное устройство для проведения эксперимента по хемотаксису. Чтобы начать эксперимент по хемотаксису, удалите часть CB из концентратора иглы входного отверстия для клеток и заполните его суспензией клеток.

Осторожно заполните шприц объемом 50 мкл суспензией клеток. Делайте это медленно, так как жгутики могут быть повреждены, что приведет к снижению подвижности. Присоедините шприц объемом 50 мкл к ступице входной иглы, как было показано ранее: выдавите небольшую каплю содержимого шприца, коснитесь этой каплей жидкости в ступице иглы и зафиксируйте шприц. Поместите устройство на предметный столик флуоресцентного микроскопа, оснащенного высокоскоростной камерой для захвата изображений.

Поместите оба входных шприца в шприцевой насос и запустите поток таким образом, чтобы сформировался градиент и клетки начали перемещаться по трубке. После того как клетки попадут в камеру хемотаксиса, подождите около 20 минут до стабилизации системы. Перед началом визуализации получите изображения флуоресценции живых (зеленых) и погибших (красных) клеток в различных точках по всей длине камеры.

Обычно мы собираем по 100 изображений в каждой точке с интервалом в три секунды. Полученные флуоресцентные изображения можно проанализировать с помощью любой коммерчески доступной программы для анализа изображений, такой как Image J или metamorph, либо используя простые коды, написанные в matlab. В данном примере мы будем использовать коды MATLAB.

Начните с удаления фоновых пикселей на изображении путем установки порогового значения интенсивности пикселей; удалите все пиксели, интенсивность которых ниже этого порога. Это позволит минимизировать шум. При анализе используйте положение погибших клеток для определения центра изображения.

Это положение, при котором клетки попадают в камеру для хемотаксиса и где они будут обнаружены при отсутствии миграции. Затем найдите живые клетки на изображении, разделите изображение на каналы и определите количество живых клеток в каждом канале. В нашей предыдущей работе камера для хемотаксиса шириной 10 50 мкм была разделена на 64 канала, ширина каждого из которых составляла около 16 мкм.

После повторения этих шагов для всех изображений суммируйте общее количество клеток для каждого канала по всем изображениям. Это позволит определить общее число клеток, обнаруженных в каждом канале за весь период эксперимента. Рассчитайте коэффициент хемотаксического разделения (CPC), который характеризует направление миграции.

Выполните следующие действия: присвойте множитель плюс один каждой клетке, расположенной в области высокой концентрации (справа), и множитель минус один каждой клетке в области низкой концентрации (слева) от погибших клеток. Просуммируйте все полученные значения и нормируйте их по общему количеству обнаруженных клеток. Рассчитайте коэффициент хемотаксиса или коэффициент миграции (CMC), который оценивает миграцию клеток в зависимости от пройденного расстояния.

Клетке, переместившейся в крайнее положение с максимальной концентрацией (канал 64), присваивается весовой коэффициент +1, тогда как клетке, переместившейся на середину в сторону более высокой концентрации, присваивается весовой коэффициент +0,5. Перемещение в крайнее положение с низкой концентрацией оценивается коэффициентом -1. Сумма всех взвешенных значений количества клеток нормализуется по общему числу клеток для расчета CMC.

На этом графике показан линейный градиент или профиль концентрации, сформированный в микрофлюидном устройстве с использованием флуоресцеинизотиоцианата. Формирование градиента концентрации на данном рисунке продемонстрировано с помощью синего и желтого красителей. Вход для клеток был закрыт, чтобы исключить поток через него, и видно, что в результате образуется диапазон цветов от синего до желтого.

Ниже представлены псевдоцветные изображения репрезентативного эксперимента по хемотаксису, в котором штамм e coli RP 4 37 подвергался воздействию градиента L-аспартата от 0 до 100 micromolar или сульфата никеля от 0 до 225 micromolar в устройстве. Миграция живых зеленых бактерий по направлению к L-аспартату или в сторону от никеля регистрировалась каждые 2,5 секунды в течение 30 минут. Мертвые бактерии, обозначенные красным цветом, служили контролем влияния потока в устройстве.

На данном графике показано пространственное распределение RP 4 37 в микрофлюидном устройстве в отсутствие градиента в сравнении с его ответом на градиент аспартата и градиент сульфата никеля. Мы только что продемонстрировали вам, как контролировать хемотаксис e coli RP 4 37 в градиенте сульфата никеля. При выполнении этой процедуры важно помнить о необходимости минимизировать вортексирование клеток, чтобы можно было использовать субпопуляцию с высокой подвижностью.

На этом всё. Спасибо за просмотр и удачи в ваших экспериментах.