Градиент генерирующих микрожидкостных Устройство для клеточной биологии

Меня зовут Цзян, я постдок в Гарварде и в отделе наук и технологий здравоохранения (HST) Массачусетского технологического института (MIT). А меня зовут Амир Манчи, я студент бакалавриата в лаборатории профессора Хасана в подразделении наук и технологий здравоохранения Гарварда и MIT.

На этом слайде представлена схема процесса изготовления устройства: сначала наносится SU-8 методом центрифугирования на поверхность силикона, затем поверх силикона помещается маска, после чего следует воздействие УФ-излучением и проявление. В итоге мы получаем эти площадки на поверхности силикона. После этого мы отливаем PDMS, выполняем отверждение и запекание, пробиваем отверстия, а затем соединяем устройство из PDMS со стеклянной подложкой с помощью кислородной плазмы.

Итак, мы находимся в помещении для микрофабрикации в лаборатории, и мы начнем с изготовления слоев ПДМС. Под ПДМС я подразумеваю полидиметилсилоксан — это органический полимер. Он является наиболее широко используемым органическим полимером на основе кремния.

Фактически, это смесь двух различных компонентов: основы силиконового эластомера и отвердителя силиконового эластомера. Соотношение составляет 10 частей основы к одной части отвердителя. Нам потребуется около 10 gram основы и, соответственно, около 1 gram отвердителя эластомера; я постараюсь тщательно перемешать основу с отвердителем до однородного состояния.

Я буду использовать пипетки. Теперь, когда смесь готова, я залью ее на кремниевую пластину. Суть в том, что на этих кремниевых пластинах нанесены определенные рисунки.

Они фактически помогают этому ПДМС-полимеру принять форму рисунка; мы используем эти шаблоны для создания каналов, желобков или любого другого необходимого нам рельефа на данных полимерах. Следующим шагом, поскольку в смеси содержится много пузырьков, мы поместим её в вакуум, чтобы удалить эти пузырьки из полимера. Я помещу гели ПДМС на кремниевую пластину внутри вакуумной камеры.

Я закрою камеру и включу вакуум. После того как пузырьки исчезнут, примерно через пару минут, мы поместим образец в печь на ночь при температуре около 70 °C, чтобы он затвердел. Обратите внимание на эти три разных резервуара, которые используются для создания градиентов: таким образом, с одной стороны у нас будет нулевая концентрация, а с другой — определенное значение, и переход между ними будет равномерным; также мы сделаем небольшое отверстие на другом конце, которое в данном случае будет служить выходом.

Следующий шаг — вырезать один из этих шаблонов и перенести его в чашку Петри, расположив поверхности шаблона лицевой стороной вверх. Надеюсь, вы видите три входа и один выход, о которых я говорил ранее, на этих шаблонах. Для создания входных отверстий мы будем использовать просечки малого диаметра, чтобы иметь возможность использовать полиэтиленовые трубки, а для выходного отверстия я буду использовать просечку большего диаметра, чтобы создать резервуар.

Итак, начнем с первого входа. Я сделаю отверстие, так же поступлю и со вторым, а для третьего сделаю еще одно маленькое отверстие. Последним этапом будет создание большого отверстия на выходе.

Таким образом, по завершении мы получим слой PDMS, который будет верхним слоем, а в качестве нижнего слоя я буду использовать еще один стеклянный слой. Эти микропредметы станут нижним слоем моих микрофлюидных устройств. Сейчас мы находимся в помещении для микрофабрикации, у меня есть стеклянная пластина и слой PDMS, и я хочу соединить их друг с другом.

Сейчас мы воспользуемся устройством, которое называется плазменный очиститель. Внутри камеры плазма способствует разрушению слабых поверхностных связей и их замене на высокореактивные химические группы; кроме того, поверхность станет гидрофильной. Сейчас я возьму форму из PDMS, которая была верхним слоем и имела внутри каналы, и сниму ленту, которую я наклеил ранее, чтобы предотвратить попадание пыли на форму.

Я помещу его внутрь камеры. Следующим шагом я возьму стеклянный слой, который представляет собой предметное стекло микроскопа; он будет служить нижним слоем внутри устройства. Поэтому я также помещу его в камеру.

Я полностью закрываю камеру, затем сначала включаю питание, затем насос, и примерно через пять минут нам нужно будет вернуться к этому прибору. Теперь я выключу прибор: сначала я выключаю насос, затем питание, после чего открываю камеру.

Этот звук на самом деле вызван отрицательным давлением, которое было создано в процессе внутри камеры. Теперь я извлеку отдельные слои и прикреплю их друг к другу. Поскольку стекло является нижним слоем, я зафиксирую его в левой руке, а затем возьму слой PDMS и помещу его поверх стеклянного слоя.

Поскольку в данный момент паттерны расположены лицевой стороной вверх, я переверну слой PDMS. Я прижму его к стеклу, после чего они плотно соединятся. Они очень легко прикрепляются, и одним из преимуществ данного процесса обработки плазмой является высокая адгезионная прочность и долговечность соединения.

Вот так это выглядит в итоге. Итак, повторюсь, здесь наши входные отверстия, а здесь выходное, и мы готовы переходить к следующему шагу. Проводим инкубацию внутри устройства в инкубаторе в течение одного часа, затем извлекаем образец из инкубатора спустя час, добавляем питательную среду для рыбных культур и готовим раствор.

Для приготовления раствора EGF в 2 мл культуральной среды добавляют 15 нг EGF и 10 мкМ 5-ZD; этот раствор используется для визуализации градиента EGF в канале. Затем берут 2 мл культуральной среды и добавляют еще 2 мл в соседний резервуар. В эти два отсека подается обычная культуральная среда в устройство.

Таким образом, я удаляю пузырек воздуха, подключаю систему снова, но этот пузырек снова опускается вниз. Затем я беру 15 нг EGF, 10 мкМ фикодекстрина и 2 мл среды из контейнера, ввожу образец в шприц и удаляю пузырек воздуха. После этого я произвожу смену раствора и возвращаю его обратно.

Раствор набирают в шприц газового типа и несколько раз нажимают на поршень, чтобы удалить пузырьки воздуха; сначала весь раствор переносится в шприц, затем переключают трехходовой кран, и раствор проходит через кран и трубку, выходя из нее. После перемешивания, когда раствор выходит из трубки, ее можно вставить в устройство My Predict, чтобы все три раствора были одинаковы. Затем аккуратно подсоедините входной разъем инфузионного канала.

Таким образом, в итоге используются два варианта: обычная культуральная среда и культуральная среда с EGF для подтверждения профиля градиента EGF. Здесь представлены клетки в сети.

Это будет выходное отверстие для клеток; градиент создается с помощью трех каналов-концентраторов, после чего градиент формируется внутри области расположения клеток. Обычно процедура заключается в следующем: мы вводим суспензию клеток через выходное отверстие, затем осторожно всасываем жидкость через сеть, в результате чего клетки автоматически перемещаются в область расположения клеток и оседают на покрытие. После этого необходимо убедиться, что клетки полностью распластались. Убедившись в полном распластывании клеток, можно начать инфузию и изучать миграцию клеток с помощью устройства для создания градиента.