Изучение Synaptic Бассейны пузырьков использованием фотопревращения стириловых красителей

В данном видео демонстрируется процедура фотоконверсии красителя Styro Dye FM 1 43. Для изучения пулов синаптических везикул у Drosophila melanogaster сначала проводят диссекцию личинок дрозофилы для обнажения вентральных мышц, которые представляют собой препарат нервно-мышечного соединения (НМС). Препараты инкубируют в буфере, содержащем FM D (показан здесь серым цветом), который маркирует клеточную мембрану.

Затем их подвергают электрической или химической стимуляции для индукции физического слияния, после чего происходит интернализация везикулярных мембран. Стимулированный экзоцитоз окрашивают красителем FM 1-43. После этого проводят промывку, чтобы удалить внеклеточный краситель FM с плазматической мембраны, и фиксируют ткань при непрерывном освещении высокой интенсивности. Краситель полностью выцветает, и черный цвет появляется за счет осаждения диаминобензидина.

Этот осадок затем можно визуализировать с помощью просвечивающей электронной микроскопии. Здравствуйте, я Филипп о Пасо из лаборатории Сильвии Олли в Европейском институте нейронаук в Гёттингене, Германия. Сегодня мы продемонстрируем вам процедуру фотопреобразования FM в нервно-мышечном соединении.

Данная процедура используется в нашей лаборатории для изучения рециркуляции синаптических везикул. Итак, приступим. Работая под диссекционным микроскопом, закрепите личинку drosophila булавками дорсальной стороной вверх в чашке с покрытием из agarose.

Покройте препарат физиологическим раствором для дрозофил, используя иглу шприца, и продольно рассеките спинную сторону ножницами для диссекции. Затем удалите внутренние органы. После этого растяните препарат и снова закрепите его булавками в чашке Петри.

Затем можно использовать несколько брюшных мышц для защиты используемых в данной процедуре красителей FM от выцветания. Эту процедуру следует проводить в условиях низкой освещенности. Покройте зафиксированный препарат Drosophila физиологическим раствором для Drosophila, содержащим 90 millimolar KCl и 10 micromolar FM 1-43, для химической стимуляции нервов.

После стимуляции инкубируйте в течение одной минуты при комнатной температуре. Удалите стимулирующий раствор и, работая под вытяжным шкафом, дважды погрузите чашку с закрепленной дрозофилой в стакан, наполненный 100 миллилитрами физиологического раствора для дрозофил, чтобы удалить внеклеточный краситель FM 1 43.

Зафиксируйте препарат нервно-мышечного соединения в 2.5% глутаральдегиде в фосфатно-солевом буферном растворе или PBS в течение 45 минут при комнатной температуре. Один раз промойте препарат раствором PBS, затем извлеките его из чашки для сигар и погрузите в 100 мМ хлорида аммония на 15 минут, чтобы инактивировать свободные альдегидные группы оставшегося глутаральдегидного фиксатора.

Промойте раствор хлорида аммония обычным PBS, перенесите препарат нервно-мышечного соединения в новую чашку для сигар и погрузите его в отфильтрованный раствор диаминобензидина (DAB) в PBS с концентрацией 1,5 mg/mL; инкубируйте в течение 30 минут при температуре 4 °C. Разместите образец под флуоресцентным микроскопом, оснащенным ртутной лампой в качестве источника света с зеркалом в корпусе лампы, используя сухой объектив с относительно низким увеличением.

Найдите образец. Затем, используя стандартный куб фильтров для синего возбуждения и зеленой флуоресценции, настройте фокус флуоресцентного сигнала. Нервно-мышечные соединения будут видны в виде ярких точек на мышцах.

Далее, используя тот же набор флуоресцентных фильтров, освещайте образец с максимальной интенсивностью до полного выгорания FM D. При использовании объектива 20x достаточно будет от 30 до 45 минут. Однако время фотоконверсии варьируется в зависимости от интенсивности освещения, степени проникновения DAB в препарат и используемого объектива.

После освещения исследуйте образец при проходящем свете. Если произошло фотопреобразование, должен быть виден темно-коричневый осадок. Вернитесь к диссекционному микроскопу, затем с помощью ножниц вырежьте область с фотопреобразованным участком из личинки.

Вернитесь к диссекционному микроскопу. Затем с помощью ножниц вырежьте участок личинки, определенный по результатам фотоконверсии. Теперь, работая в вытяжном шкафу и используя соответствующие средства индивидуальной защиты, включая перчатки и защитные очки, поместите образец в микроцентрифужную пробирку с PBS.

Подготовьте по 300 µL 1% тетраоксида осмия для каждого образца. Поместите образец в стеклянную колбу с пластиковой крышкой и добавьте приготовленный раствор тетраоксида осмия для фиксации препарата. Пока образец инкубируется, приготовьте отдельные растворы этанола с концентрациями 30, 50, 70, 90, 95 и 100%.

Промойте образец четыре-пять раз раствором PBS по пять минут за каждую промывку. После каждой промывки используйте пластиковый наконечник для пипетки, чтобы перенести образец в новую колбу. После последней промывки перенесите образец в чистую стеклянную колбу.

Затем обезводьте образец, поместив его в серию растворов этанола. Начните с инкубации в одном миллилитре 30% ethanol. Затем через пять минут удалите этанол с помощью пастеровской пипетки и замените его одним миллилитром 50% ethanol.

Продолжите обезвоживание, инкубируя препарат нервно-мышечного соединения в 70%, 90% и затем 95% растворах. Затем образец инкубируют в 95% растворе этанола дважды, после чего трижды инкубируют в 100% этаноле. Добавьте два миллилитра смолы EIN в этаноле в соотношении один к одному и поместите образец в ротационный инкубатор.

Выдержите от двух до четырех часов при комнатной температуре после центрифугирования при 100% ein, затем поместите образец в открытую колбу, чтобы дать оставшемуся этанолу испариться в течение четырех-шести часов. Налейте свежий EIN в форму. Добавьте подготовленные образцы и инкубируйте при 60 °C в течение 36 часов.

Когда препараты, залитые в EIN, будут готовы, используйте ультрамикротом и алмазный нож для приготовления ультратонких срезов толщиной от 50 до 80 нанометров. Образцы нарезают на тонкие срезы. Срезы всплывают на поверхности водяной бани ножа, после чего их можно перенести на стандартные EM-сетки.

Теперь препараты готовы к визуализации с использованием стандартных процедур электронной микроскопии. Изолированные нервно-мышечные соединения *Drosophila melanogaster* стимулировали с помощью высокого содержания калия, а интернализованные мембраны окрашивали красителем FM 1-43, как показано здесь.

Флуоресценцию нервного окончания можно наблюдать с помощью обычного эпифлуоресцентного микроскопа. При непрерывном освещении краситель полностью выгорает, и по мере продолжения освещения появляется черный цвет из-за выпадения в осадок динобензина. Это нервное окончание содержит синаптические везикулы, однако ни одна из них не подверглась фотоконверсии.

Это может быть вызвано недостаточной освещенностью или плохим проникновением диаминобензидина в ткань. Напротив, слишком интенсивное освещение приводит к общему потемнению терминали, при котором везикулы или органеллы становятся неразличимыми; при соответствующем уровне освещенности можно наблюдать фотоконверсию. На этом микрофотографическом снимке показан синаптический бутон, в котором виден скоп темных везикул, что указывает на фотоконверсию FM.

Мы только что продемонстрировали вам способ фотоконверсии синаптических везикул, меченных красителем fem. При выполнении этой процедуры важно помнить о необходимости всегда тщательно калибровать время освещения для этапа конверсии. На этом всё.

Благодарим за просмотр. Желаем успехов в ваших экспериментах.