Количественный анализ Synaptic пополнение бассейна пузырьков в культуре нейронов мозжечка гранул использованием FM Красители

Общая цель следующего эксперимента заключается в количественной оценке восполнения и мобилизации специфических пулов синаптических везикул в центральных нервных терминалях с помощью методов прижизненной флуоресцентной визуализации. Это достигается путем мониторинга двух раундов рециклирования синаптических везикул с использованием красителей FM в одних и тех же нервных терминалях для обеспечения достоверного внутреннего контроля. На втором этапе readily releasable pool (легко высвобождаемый пул) и reserve pool (резервный пул) последовательно истощаются с помощью специфических протоколов вымывания, что позволяет количественно оценить относительные размеры пулов.

Затем измените условия загрузки или выгрузки, чтобы изучить влияние выбранного параметра на синаптические везикулы, восполнение пула или мобилизацию. Результаты показывают, что загрузка FM d различных физических синаптических пулов воспроизводима, что подтверждается количественным определением и анализом вызванной выгрузки красителя. Основным преимуществом данного метода перед существующими, такими как семейство генетических репортеров fluent, является то, что этот метод позволяет отслеживать восполнение пулов конкретно синаптическими везикулами, прошедшими эндоцитоз.

Это также позволяет проводить точный количественный анализ. Поскольку данный протокол выполняется дважды на одних и тех же нервных терминалях, обеспечивается внутренний контроль. Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы в области синаптического CLE, эндоцитоза и экзоцитоза, например, каким образом манипуляции с конкретными режимами эндоцитоза могут повлиять на восполнение как общего рециклирующего пула, так и входящих в него синаптических пулов CLE, таких как легко высвобождаемый пул и резервный пул.

Базовая экспериментальная установка должна состоятельно из инвертированного эпифлуоресцентного микроскопа, охлаждаемой CCD-камеры, источника флуоресцентного света, аппарата для гравитационной перфузии, камеры для визуализации с параллельными платиновыми электродами, электрического стимулятора и компьютера. Проводите эксперименты в темноте или при красном свете с минимальным флуоресцентным освещением образца, чтобы избежать выцветания FM-красителя. Начните выполнение данной процедуры с подготовки первичных культур нейронов зернистого слоя мозжечка из семидневных крысят линии Sprague Dawley.

После подготовки культур высейте нейроны в центре покровного стекла диаметром 25 мм, покрытого поли-D-лизином, в виде капли, диаметр которой не должен превышать 7 мм. Через один час добавьте к нейронам 2 мл питательной среды. Через семь дней поместите одно покровное стекло в физиологический раствор при комнатной температуре на 10 минут для стабилизации в новой среде. После этого извлеките покровное стекло, промокните его нижнюю сторону и область вокруг прикрепленных клеток небольшим кусочком бумажного полотенца или абсорбирующей бумаги.

Затем с помощью силиконовой смазки приклейте покровное стекло к дну измерительной камеры. Клетки должны находиться между двумя параллельными проволоками. Используйте достаточное количество силиконовой смазки, чтобы полностью герметизировать камеру, не допуская ее попадания в центр измерительной камеры.

Затем осторожно заполните камеру ванны примерно 260 µL физиологического раствора. После этого заполните входную и выходную трубки тем же раствором. Герметизируйте камеру, прикрепив чистое покровное стекло к верхней части с помощью силиконовой смазки.

После этого удалите все пузырьки воздуха, попавшие в камеру, с помощью входной и выходной трубок. Затем закрепите камеру для визуализации на платформе из нержавеющей стали. Проверьте систему на наличие утечек, осторожно пропустив физиологический раствор через входную трубку.

Следующим шагом является установка собранной камеры на предметный столик инвертированного микроскопа. Заполните входное отверстие системы гравитационной перфузии физиологическим раствором и подсоедините к нему камеру. Затем подключите соединительные провода камеры к электрическому стимулятору.

Проведите перфузию нейронов 1,5 миллилитрами разведенного красителя FM. Затем простимулируйте нейроны с помощью подключенного стимулятора для инициации захвата красителя. После стимуляции проведите перфузию нейронов свежим физиологическим раствором в течение двух минут, чтобы удалить излишки красителя FM. Затем выдержите нейроны в физиологическом растворе в течение восьми минут.

Тем временем найдите аксональные сети, в которых видны отдельные нервные терминали, нагруженные FM D. Используйте длину волны флуоресцеина. Избегайте участков с скоплениями клеток.

Затем снова сфокусируйте изображение непосредственно перед началом съемки, так как за время периода отдыха мог произойти небольшой дрейф. Начните таймлапс-съемку с частотой один кадр каждые четыре секунды. После получения от 5 до 10 базовых изображений вызовите экзоцитоз readily releasable pool, подав стимуляцию частотой 30 hertz в течение двух секунд.

После получения еще 10 изображений вызовите экзоцитоз синаптических везикул из резервного пула, применив три стимуляции частотой 40 hertz продолжительностью 10 секунд с интервалом 40 секунд между стимуляциями, и получите еще от пяти до 10 изображений. Затем приостановите сбор изображений. Дайте нейронам восстановиться в течение как минимум 20 минут, и повторите данный протокол фазы S1 в фазе S2 для контрольного эксперимента.

Для анализа данных преобразуйте изображения в стек. Используя встроенную функцию ImageJ, отрегулируйте яркость и контрастность стека для максимизации динамического диапазона, если произошел значительный горизонтальный дрейф. В ходе эксперимента используйте плагины Stack Reg и Turbo Reg в ImageJ для выравнивания стека изображений.

Затем запустите плагин runtime series analyzer. Далее определите области интереса (ROI) как минимум в 90 нервных терминалях. Для выявления активных нервных терминалей рекомендуется переключаться между изображениями до и после вымывания красителя.

Идеальный размер области интереса должен быть немного больше типичного нервного окончания. Затем определите общую интенсивность флуоресценции для каждой области интереса с течением времени. После этого экспортируйте данные в Microsoft Excel.

Здесь представлена блок-схема контрольного эксперимента, в котором гранулярные нейроны мозжечка были нагружены 10 µM FM 1 43 при стимуляции с частотой 80 Hz в течение 10 seconds. На данном изображении показаны нервные терминали, нагруженные FM 1 43. На этом же изображении отмечены 90 пронумерованных областей интереса, выбранных для анализа после идентификации активных нервных терминалей; далее представлены изображения нервных терминалей в выбранные моменты времени.

Эти изображения представлены в псевдоцветах для иллюстрации изменений флуоресценции по мере истощения различных пулов синаптических везикул. Наконец, здесь приведены нормированные единицы флуоресценции этих 90 нервных терминалей. На фазах S one и S two можно измерить снижение флуоресценции при каждой последовательной стимуляции и сравнить эти показатели между фазами S one и S two.

В данном контрольном эксперименте как S one, так и S two привели к одинаковым размерам readily releasable и reserve пулов. После просмотра этого видео вы должны хорошо понимать, как количественно определить восполнение и мобилизацию специфических пулов синаптических пузырьков в центральных нервных терминалях с помощью методов флуоресцентной визуализации в режиме реального времени. При выполнении данной процедуры важно не забыть подтвердить жизнеспособность и отклик клеток, проведя контрольные эксперименты с S one перед изменением экспериментальных условий S two.