Расшифровка аксонального Пути генетически определенные группы нейронов в Чик нервной трубки Используя В ово Электропорация
2 мая 2010 г.
В этом видеоролике показано, как визуализировать аксонального пути генетически определенных групп нейронов в эмбриональном куриных спинного мозга использования В ово Электропорации репортер генов под контролем конкретных элементов усилителя.
Здравствуйте, я Хам из лаборатории доктора Кляра на кафедре медицинской нейробиологии Еврейского университета в Иерусалиме. Здравствуйте, я Софи Эсман, я также работаю в лаборатории Ларса. Сегодня мы продемонстрируем вам процедуру электропорации in vivo и подготовку препарата спинного мозга методом «открытой книги».
В нашей лаборатории мы используем данную процедуру для изучения траекторий аксонов генетически определенных популяций нейронов в спинном мозге эмбриона. Итак, приступим. Для начала процедуры перенесите оплодотворенные яйца белой леггорна из помещения с комнатной температурой в увлажненный инкубатор, предпочтительно с качающимися лотками, при температуре от 37 до 38 °C.
Важно контролировать температуру и влажность в инкубаторе для получения жизнеспособных и синхронизированных эмбрионов. Электропорацию эмбрионов цыплят проводят, когда они достигают стадии 18–20 по Гамбургеру и Гамильтону (HH), которая является оптимальной для специфической экспрессии, зависящей от энхансера. На этой стадии голова расположена под прямым углом к туловищу.
Также на стадиях HH 18–20 должен наблюдаться обширный набор внезародышевых кровеносных сосудов, таких как передние и задние правый и левый витальные сосуды. Эмбрионы цыплят достигают стадий HH 19–20 через 66 часов инкубации; в это время извлеките яйца из инкубатора. После извлечения расположите яйца горизонтально и подождите от 5 до 10 минут. Теперь эмбрион находится у верхнего полюса яйца.
Перед электропорированием эмбрионов приготовьте раствор Хэнка с добавлением 100 единиц на миллилитр пенициллина и 0,1 миллиграмма на миллилитр стрептомицина. Подготовьте необходимую смесь ДНК в концентрации от 2 до 5 микрограмм на микролитр и добавьте несколько крупинок красителя fast green для облегчения визуализации инъецируемой ДНК. Также подготовьте ротовую пипетку, стерильную иглу шприца, маленькие ножницы и лейкопластырь.
Подготовьте микрокапилляры, вытянув стеклянные капилляры диаметром 0,5 millimeter с помощью вытяжки для пипеток. Установите вольфрамовые электроды в микроманипуляторы и подключите электроды к генератору импульсов. Установите на генераторе импульсов напряжение минус 30 volts, длительность каждого импульса 50 milliseconds и количество импульсов — три.
Приступайте к электропорации перед тем, как извлекать и обрабатывать эмбрионы. Введите шприц с узкого полюса яйца и удалите из каждого яйца от пяти до шести миллилитров альбумина. Альбумин удаляют, чтобы предотвратить его вытекание.
При выполнении разреза на следующем этапе используйте маленькие ножницы. После обнаружения эмбриона цыпленка прорежьте овальное окно в верхней части яйца и увлажните его 0,5–1 мл раствора Хенкса с пенициллином и стрептомицином. Затем с помощью ротового дозатора заполните стеклянный микрокапилляр.
При использовании смеси красителя для ДНК микрокапилляр соответствующего диаметра должен легко заполняться ДНК. Под бинокуляром расположите эмбрион для инъекции ДНК в нервную трубку. Поместите эмбрион хвостом к себе.
На данной стадии развития спинной мозг отчетливо виден, поэтому в применении контрастирующих методов нет необходимости. Спинной мозг герметично закрыт как со стороны головы, так и со стороны хвоста. Однако при выполнении проколов микрокапилляром в нейронной трубке следует создавать отверстия и проникать в неё под малым углом; при этом микрокапилляр должен быть достаточно тонким и иметь подходящий диаметр, чтобы пройти сквозь трубку, не повредив её.
Введите ДНК с помощью пипетки-дозатора. Микрокапилляр подходящего диаметра должен обеспечить высвобождение ДНК при равномерном выдохе. Зеленый краситель должен распространиться от кончика хвоста до пузырей развивающегося головного мозга.
Введите раствор до полного заполнения нейральной трубки; для проникновения введенной ДНК в клетки необходима электропорация. Сначала расположите электроды параллельно нейральной трубке и как можно ближе к ней, не касаясь самой трубки. Убедитесь, что электроды погружены в жидкость для обеспечения электропроводности во время подачи импульса.
Обычно раствора Хэнкса, добавленного сразу после обнажения эмбриона, бывает достаточно. Если же этого недостаточно, непосредственно перед подачей импульса добавьте одну каплю раствора Хэнкса, поместите электроды в жидкость и подайте импульс для электропорации, после чего осторожно извлеките электроды и заклейте окно и яйцо лентой. Важно полностью герметизировать яйцо, чтобы предотвратить высыхание эмбриона в течение последующего периода инкубации.
Поместите яйцо обратно в инкубатор и инкубируйте до тех пор, пока эмбрион цыпленка не достигнет шестого дня эмбрионального развития. Когда наступит время для визуализации и эмбрион после электропорации достигнет шестого дня развития (E6), что соответствует трем дням после электропорации, извлеките его из яйца с помощью тонких ножниц и перенесите в покрытую силиконом чашку Петри с PBS.
Обрежьте мембраны и зафиксируйте эмбрион, растянув его по вентральной стороне с помощью булавок, вставленных в силикон. С помощью острого вольфрамового микрокапилляра сделайте продольный разрез вдоль крышной пластинки от заднего мозга до хвоста.
Сделайте два дополнительных продольных разреза по обеим сторонам спинного мозга, отделяя спинальные ганглии (DRGs) от спинного мозга. Отделите вентральную пластинку от ткани, двигаясь от хвоста к заднему мозгу, оставляя спинной мозг нетронутым. В завершение, используя тонкие ножницы, сделайте поперечный разрез спинного мозга в области заднего мозга и отделите спинной мозг от тела.
После выделения спинного мозга перенесите его в новую чашку Петри с силиконовым покрытием, содержащую PBS, и распластайте его, используя булавки для фиксации от заднего мозга до хвоста, чтобы создать препарат в виде плоского mount-препарата. Зафиксируйте спинной мозг в 4% паральдегиде в PBS в течение одного часа при комнатной температуре, затем проведите иммуноокрашивание согласно детальной процедуре иммуногистохимии и прилагаемому письменному протоколу для закрепления раскрытого спинного мозга. Подготовьте препарат к визуализации.
Нанесите жир или силикон на предметное стекло в форме прямоугольника и капните PBS внутри этого прямоугольника. С помощью пинцета поместите спинной мозг, растянув его по центру прямоугольника, и удалите лишнюю жидкость вокруг него. С помощью дозатора нанесите одну или две капли среды для заключения на спинной мозг и накройте покровным стеклом.
Надавите на покровное стекло, чтобы избежать появления пузырьков воздуха. Храните предметные стекла в темноте при температуре 4 °C.
Проведите исследование спинного мозга с помощью конфокальной микроскопии. Ниже представлены репрезентативные результаты прослеживания аксонов интернейронов спинного мозга цыпленка в контрольных экспериментах, где RFP экспрессируется во всех нейронах с использованием убиквитарного энхансера CMV; большинство нейронов и их аксонов окрашены. В таких условиях невозможно определить траекторию аксонов отдельных субпопуляций нейронов.
Однако при применении специфических усиливающих элементов выявляется определенный аксональный путь конкретной субпопуляции нейронов DI 2, как в данном примере. Таким образом, мы продемонстрировали, как проводить электропорацию нейральной трубки цыпленка со специфическим нейрональным энхансером на стадии E3 и как подготовить спинной мозг в виде «открытой книги» на стадии E6. При выполнении этой процедуры следует помнить о необходимости осторожности и терпения.
На этом всё. Спасибо за просмотр и успехов в ваших экспериментах. Желаем удачи.
Просмотрите полный транскрипт и получите доступ к тысячам научных видео
Обзор
В данном видео демонстрируется процедура визуализации аксональных путей генетически определенных нейронов в спинном мозге эмбриона цыпленка с помощью электропорации in ovo. Этот метод позволяет исследователям эффективно изучать траектории аксонов.
Основные компоненты исследования
Область науки
- Нейробиология
- Биология развития
- Электрофизиология
Теоретическая часть
- Понимание аксональных путей имеет решающее значение для нейробиологических исследований.
- Электропорация in ovo представляет собой метод, используемый для введения репортерных генов.
- Спинной мозг эмбриона цыпленка служит моделью для изучения развития нейронов.
- Генетически определенные популяции нейронов могут дать представление о специфических нейронных цепях.
Цель исследования
- Визуализация аксональных путей в спинном мозге эмбриона.
- Использование электропорации in ovo для исследований экспрессии генов.
- Углубление понимания развития и связности нейронов.
Используемые методы
- Перенесите оплодотворенные куриные яйца в увлажненный инкубатор.
- Поддерживайте инкубацию при температуре от 37 до 38 °C.
- Выполните электропорацию in ovo для введения репортерных генов.
- Подготовьте препараты спинного мозга методом «открытой книги» для визуализации.
Основные результаты
- Успешная визуализация аксональных путей в спинном мозге.
- Демонстрация эффективности электропорации in ovo.
- Представление данных о траекториях генетически определенных популяций нейронов.
- Разработка надежного метода изучения развития нейронов.
Выводы
- Данный метод представляет собой ценный инструмент для нейробиологических исследований.
- Электропорация in ovo эффективна для доставки генов в эмбриональные модели.
- Понимание путей прохождения аксонов может быть полезным при изучении формирования нейронных сетей.
Часто задаваемые вопросы
Практическая значимость для промышленности
Данный метод обеспечивает точную визуализацию траекторий аксонов в генетически определенных популяциях нейронов, решая ключевую проблему валидации мишеней, при которой билатеральное мечение затрудняет разграничение ипсилатеральных и контралатеральных проекций. Ограничивая экспрессию репортера одной стороной нервной трубки с помощью односторонней электропорации in ovo, исследователи могут на ранних этапах поиска снизить риски, связанные с механистическими гипотезами о нейронных цепях. Этот подход повышает прогностическую уверенность при выборе мишени за счет уточнения паттернов связности конкретных путей, имеющих значение для моделей нейроонтогенетических заболеваний.
Стратегическое применение в биофармацевтических исследованиях и разработках
Ранний поиск и валидация мишени
- Научная ценность: позволяет проверять терапевтические гипотезы путем изоляции аксональных проекций специфических субпопуляций нейронов, определенных репортерами под управлением энхансеров.
- Практическая ценность: обеспечивает одностороннее мечение для разграничения ипсилатеральных и контралатеральных проекций аксонов, что снижает неопределенность при картировании нейронных цепей.
- Прогностическая ценность: способствует биологическому снижению рисков при выборе мишеней, уточняя, задействует ли популяция нейронов возбуждающие или тормозные пути, критически важные для механизма заболевания.
Скрининг и разработка анализа
- Научная ценность: Позволяет получать количественные данные о траектории аксонов в качестве фенотипического показателя для скрининга генетических или фармакологических модуляторов нейрональной навигации.
- Практическая ценность: Обеспечивает получение стандартизированных, воспроизводимых препаратов целых образцов, совместимых с конфокальной микроскопией высокого разрешения и автоматизированными конвейерами анализа.
- Ценность масштабируемости: Использует модель эмбриона курицы, которая позволяет масштабировать тестирование активности энхансеров или эффективности электропорации для множества условий.
Трансляционные и доклинические исследования
- Трансляционная ценность: Позволяет картировать релевантные для заболевания аксональные пути в моделях спинного мозга позвоночных, что обеспечивает сопоставление с биомаркерами нейроонтогенетических расстройств у человека.
- Механистическая преемственность: Обеспечивает переход от стадии валидации мишени к доклинической оценке эффектов препаратов на уровне нейронных цепей в отношении роста или наведения аксонов.
- Прогресс с учетом рисков: Помогает принимать решения о продолжении или прекращении исследований (go/no-go), выявляя, модулирует ли мишень специфические паттерны проекций, связанные с функциональным восстановлением или патологией.
Интеграция в конвейер и рабочий процесс
Данный метод встраивается в континуум открытий — от генерации гипотез о мишенях до идентификации перспективных соединений-лидеров, обеспечивая понимание механизмов, которое предшествует разработке функциональных тестов и способствует согласованию трансляционных биомаркеров.
- Открывающая биология: Обеспечивает проверку гипотез о специфичной для энхансера экспрессии генов при определении нейрональных субпопуляций и траекторий их аксонов.
- Скрининг: Позволяет создавать готовые к анализу биологические системы со стандартизированной односторонней экспрессией репортера для оценки влияния соединений на наведение аксонов.
- Аналитика: Обеспечивает количественные пространственные данные о паттернах аксональных проекций, что упрощает сравнение различных генетических условий или вариантов терапии.
- Трансляционные исследования: Связывает результаты с доклинической работой путем создания моделей аксональных путей, релевантных конкретным заболеваниям, для корреляции с биомаркерами.
- Корпоративное повторное использование: Создает многократно используемую платформу для итеративного тестирования генетических конструкций, элементов энхансеров или параметров электропорации для различных нейрональных мишеней.
Операционное и корпоративное воздействие
- Научная ценность: Повышает достоверность прогнозов при валидации мишеней за счет определения направленности аксональных проекций, что является критическим фактором при оценке эффектов препаратов, специфичных для конкретных нейронных цепей.
- Операционная ценность: Повышает воспроизводимость и стандартизацию благодаря определенным параметрам электропорации (напряжение, длительность импульса, количество импульсов) и поэтапной обработке эмбрионов.
- Стратегическая ценность: Повышает эффективность использования капитала, позволяя на ранних этапах снизить риски, связанные с мишенями, чьи аксональные пути не соответствуют желаемым терапевтическим механизмам.
- Влияние на портфель: Обеспечивает приоритезацию с учетом рисков путем выявления мишеней, которые модулируют специфические паттерны проекций, имеющие значение для клинических конечных точек при нейроонтогенетических показаниях.
Особенности реализации
- Требуются навыки владения эмбриологическими методами, включая стадирование эмбрионов, микроинъекции и оптимизацию параметров электропорации.
- Метод зависит от наличия такого оборудования, как генераторы импульсов, микроманипуляторы, вольфрамовые электроды и конфокальный микроскоп для визуализации.
- Для получения воспроизводимых результатов необходима стандартизация концентрации ДНК, подбор элементов-энхансеров и точность размещения электродов независимо от пользователя или лаборатории.
- При переносе данной модели на другие системы позвоночных или типы нейронов, отличные от интернейронов спинного мозга, требуются соответствующие адаптации.
- Практические ограничения включают чувствительность жизнеспособности эмбрионов к условиям инкубации, а также техническую сложность достижения равномерной односторонней электропорации без повреждения нейральной трубки.
