Анализ Ответы Мышь обонятельной сенсорных нейронов Использование воздушного фазы Electroolfactogram Запись

Препарат обонятельного эпителия закрепляют на чашке и помещают в поток увлажненного воздуха. Под диссекционным микроскопом референтный электрод электрически соединяют с тканью через буферный раствор. Регистрирующий электрод помещают на поверхность обонятельного эпителия.

Обонятельный эпителий стимулируют с помощью компьютерно-управляемых порций одорантов, подаваемых в поток увлажненного воздуха, который переносит одоранты к обонятельному эпителию. Сигналы ЭОГ передаются через усилитель и дигитайзер на компьютер для записи. Здравствуйте, я Кэтрин Сиар из Лаборатории гигиены XO кафедры биологии Университета Джонса Хопкинса.

Сегодня мы продемонстрируем процедуру записи электроольфактограммы у мышей. В нашей лаборатории этот метод используется для изучения ответов обонятельных сенсорных нейронов на запахи. Итак, приступим.

Записывающая установка состоит из регистрирующего электрода, электрода сравнения, трубки для подачи воздуха, предметного столика и диссекционного микроскопа; все компоненты закреплены на пневматическом столе внутри клетки Фарадея. Для размещения электродов в трубке подачи воздуха используются микроманипуляторы. Непрерывный поток воздуха пропускается через дистиллированную воду для увлажнения перед подачей через трубку подачи воздуха на образец.

В качестве поверхности для закрепления образца используется чашка для культивирования диаметром 60 мм, заполненная гардой толщиной от six до eight мм. В гарде в закрепляющей чашке вырезаются лунка и канал, чтобы обеспечить возможность электрического соединения электрода сравнения с образцом через модифицированный раствор Рингера.

Регистрирующий и референсный электроды подключены к усилителю. Сигналы с усилителя поступают на дигитайзер, а затем на компьютер. Для управления протоколом стимуляции, регистрации сигналов и анализа ответов используется программное обеспечение XI graph.

Осциллограф подключается после усилителя для мониторинга электрического потенциала в режиме реального времени при установке регистрирующего электрода, а также во время регистрации ЭОГ. Подача ольфакторных стимулов контролируется с помощью пико-распылителя (pico spritzer), который подключен к тому же компьютеру, что используется для сбора сигналов, непосредственно перед подачей стимула.

Выход пико-распылителя подключается к флакону с жидким одорантом. Затем флакон соединяется с трубкой подачи воздуха. Теперь рассмотрим, как подготовить электроды для проведения регистрационных экспериментов.

Регистрирующий электрод представляет собой серебряно-хлоридную проволоку в вытянутом стеклянном капилляре, заполненном модифицированным раствором Рингера. Электрод сравнения представляет собой серебряно-хлоридную проволоку. Подготовку обоих электродов начинают с установки серебряной проволоки в держатель электрода.

Для регистрирующего электрода из конца держателя электрода должен выступать отрезок провода длиной от одного до двух сантиметров. Для электрода сравнения можно оставить более длинный участок провода. Чтобы нанести покрытие из хлорида серебра, поместите провод в 0,1 молярный раствор хлорида натрия и подключите держатель электрода к положительному полюсу источника постоянного тока с напряжением от 1,5 до 9 В.

Отрицательный вывод источника питания должен быть электрически соединен с 0,1 молярным раствором хлорида натрия. Дайте реакции хлоридов протекать в течение 10 минут для выравнивания любого статического заряда между регистрирующим и электродами сравнения. Перед установкой электродов в регистрирующий аппарат кратко коснитесь их друг с другом.

Затем вытяните стеклянный капилляр с помощью микропипеточного вытягивателя. Отверстие на кончике капилляра должно иметь диаметр примерно от 5 до 10 микрон. Используйте алмазный карандаш, чтобы надрезать и отломить тупой конец капилляра так, чтобы он был примерно на два сантиметра длиннее серебряной проволоки.

Используйте бутановую горелку для огневой полировки срезанного конца, затем расплавьте 0,5% agros в модифицированном растворе Рингера. С помощью переносной пипетки втяните небольшое количество расплавленного раствора agros в кончик электрода, используя шприц, который был нагрет и вытянут для получения длинного тонкого конца. Заполните вытянутый капилляр примерно наполовину.

Используя модифицированный раствор Рингера, аккуратно постучите по капилляру, чтобы удалить пузырьки воздуха. Храните заполненный электрод в сосуде для хранения с небольшим количеством модифицированного раствора Рингера на дне до момента использования. Как только образец ткани будет подготовлен и готов к регистрации, установите заполненный капилляр на провод регистрирующего электрода, подготовив электроды к работе.

Рассмотрим эксперимент по регистрации, начав с подготовки ткани к записи. Удалите кожу, покрывающую череп умерщвленной мыши, и рассеките голову пополам по срединной линии; закрепите одну половину головы медиальной стороной вверх на монтажном блюде. Осторожно удалите перегородку, чтобы обнажить носовые раковины.

Поместите чашку с закрепленной тканью на регистрирующую платформу. Отрегулируйте положение платформы так, чтобы место регистрации на носовых раковинах находилось по центру под микроскопом. Затем откройте баллон с воздухом, чтобы подавать увлажненный воздух на поверхность носовых раковин со скоростью примерно 600 milliliters per minute.

Расположите трубку для подачи воздуха так, чтобы она находилась примерно в 10 миллиметрах от места регистрации. Установите усилитель в режим DC, так как усиление AC приведет к появлению артефактов в сигнале ЭОГ. Выполните регистрацию с использованием фильтра нижних частот 1 килогерц и коэффициентом усиления 100 x.

Теперь установите регистрирующий и референтный электроды на микроманипуляторы. Опустите референтный электрод в лунку на монтажном блюде и залейте его модифицированным раствором Рингера так, чтобы обеспечить электрический контакт с тканью. Осторожно опустите регистрирующий электрод на поверхность носовой раковины 2B или 3.

Электрод должен едва касаться поверхности обонятельного эпителия. Когда электрод вступит в контакт с эпителием, на осциллографе появится прямая базовая линия. Теперь подсоедините флакон с одорантом к боковому порту трубки подачи воздуха на компьютере.

Запустите протокол стимуляции. Частота дискретизации при сборе данных должна составлять 2 kHz или более. Программное обеспечение инициирует подачу импульса запаха и начнет запись.

Типичный протокол стимуляции может представлять собой одиночный парный импульс длительностью 100 миллисекунд, два импульса по 100 миллисекунд с интервалом в одну секунду или один непрерывный импульс длительностью десять секунд. Чтобы минимизировать адаптацию, выдерживайте интервал от одной до пяти минут между протоколами после подачи высоких концентраций запаха. Поскольку в трубке может остаться остаточный запах, промойте воздушную трубку 95% ethanol и высушите ее перед началом работы с дополнительными образцами тканей.

Программное обеспечение Axo graft предоставляет инструменты для измерения ключевых параметров сигнала ЭОГ. К таким параметрам относятся амплитуда ответа, латентный период, время достижения пика и постоянная времени затухания. Некоторые параметры ЭОГ особенно полезны для сравнения нормированных ответов между мышами, включая амплитуду ответа, время нарастания латентности, время достижения пика и постоянную времени затухания.

Здесь представлены ольфакторные гломерулы (OGs) мыши в ответ на стимуляцию возрастающими концентрациями жидкого амилацетата. Черная линия сверху указывает время и продолжительность стимуляции одорантом. Здесь показана зависимость «доза-ответ», усредненная по пяти мышам; планки погрешностей соответствуют 95% доверительным интервалам.

При очень высоких концентрациях запаха часто наблюдается снижение амплитуды пика. В качестве примера приведен ЭОГ в ответ на парную импульсную стимуляцию: один короткий импульс пахучего вещества вызывает адаптацию, длящуюся несколько секунд. Здесь показана ЭОГ в ответ на 10 секунд непрерывной стимуляции пахучим веществом.

ЭОГ демонстрирует десенсибилизацию при непрерывном воздействии одоранта. Мы только что показали вам, как регистрировать электроольфактограмму у мышей. При выполнении этой процедуры важно помнить, что электрод следует помещать непосредственно на поверхность эпителия, не вводя его под поверхность.

Всегда проводите запись с одной и той же стороны головы и избегайте изменений в установке для минимизации вариативности; поддерживайте ткань увлажненной, но без образования капель жидкости. Помещение ткани под увлажненный воздух сразу после диссекции позволит сохранить ее в наилучшем состоянии для записи. На этом всё. Спасибо за просмотр и удачи в ваших экспериментах.