Изображений Запах-Вызванные деятельности в мышь обонятельной луковице с помощью программы оптического отражения и флуоресценции Сигналы

Общая цель данного эксперимента заключается в картировании активности, вызываемой запахами, на поверхности обонятельной луковицы мышей с использованием внутренних оптических сигналов и автофлуоресцентных сигналов флавопротеинов (FAS-визуализация) после анестезии мыши и обнажения черепа. Кость над обонятельной луковицей истончается. С помощью кончика скальпеля вырезается костный лоскут, который затем удаляется; из стоматологического цемента изготавливается камера, окружающая обнаженную поверхность обонятельной луковицы.

Его заполняют агарозой, и сверху на препарат помещают покровное стекло. Ольфакторные карты получают последовательно у одной и той же мыши, используя внутренние оптические сигналы и визуализацию FAS. Визуализация других вызванных активностей в обонятельной луковице мыши с помощью сигналов оптического отражения и автофлуоресценции может помочь ответить на ключевые вопросы, касающиеся пространственного распределения порядков в обонятельной луковице. Основным преимуществом данного метода перед существующими такими, как визуализация уровня глюкозы или фМРТ, является возможность регистрировать вызванную активность порядков с пространственным разрешением одного гломерулярного слоя.

Как правило, специалисты, только начинающие осваивать эти методы, сталкиваются с трудностями на начальном этапе работы, поскольку как хирургические, так и инструментальные навыки приобретаются медленно. Визуальная демонстрация данного метода имеет решающее значение для привлечения внимания к ключевым этапам хирургических и визуализирующих процедур. Зажмите заднюю лапу мыши, чтобы подтвердить действие анестезии, и удалите шерсть с кожи головы с помощью машинки для стрижки.

Удалите остатки шерсти с кожи с помощью стерильных марлевых салфеток, смоченных в дистиллированной воде. Поместите мышь в стереотаксическую раму так, чтобы носик находился в одной плоскости с затылком. Чтобы расположить обонятельную луковицу горизонтально, надежно зафиксируйте ушные и носовые фиксаторы для предотвращения смещения.

Нанесите глазную мазь на глаза, чтобы предотвратить пересыхание во время визуализации, затем продезинфицируйте область скальпа раствором Betadine, используя стерильные ножницы. Сделайте разрез на затылке между ушами, затем рассеките кожу в обе стороны по направлению к основанию ушей и в передне-заднем направлении к лбу вдоль век. Завершите удаление скальпа, разрезав кожу на рыле.

Используя носовую планку в качестве ориентира, поместите животное под стереомикроскоп и с помощью ватного тампона, смоченного в физиологическом растворе, осторожно отделите надкостницу в верхней части черепа. С помощью пинцета удалите оставшиеся ткани и зачистите поверхность черепа скальпелем, чтобы обеспечить чистоту препарата и поддерживать область обонятельной луковицы увлажненной на протяжении всего эксперимента.

Поместите кусочек рассасывающейся желатиновой губки, смоченной дистиллированной водой, на кость над обонятельной луковицей, расположенной между глаз. Удалите желатиновую губку и аккуратно соскоблите кость скальпелем с лезвием № 10. Сохраняйте постоянный угол 45 градусов между лезвием и костью, перемещая лезвие от век к сагиттальной стороне области луковицы.

В процессе истончения следует соблюдать осторожность, чтобы не оказывать вертикального давления на кость и не поцарапать ее над венозным синусом. Каждые пять минут делайте перерыв и накладывайте на кость увлажненную желатиновую губку, чтобы охладить препарат. Протирайте череп губкой для удаления костной пыли и периодически очищайте кончик скальпеля, чтобы он оставался чистым и острым.

Продолжайте процедуру до тех пор, пока не станет виден слой губчатой кости или трабекула. Когда визуализируется тонкая сеть сосудов обонятельной луковицы, прекратите соскабливание кости и с помощью кончика скальпеля № 11 очертите прямоугольную область, замыкающую обонятельную луковицу. Продолжайте соскабливать кость внутри прямоугольной области, следя за тем, чтобы окно оставалось в пределах границ венозных синусов.

Будьте предельно осторожны с глубиной погружения кончика скальпеля, чтобы не задеть поверхность твердой мозговой оболочки. Чтобы оценить толщину оставшейся кости, осторожно надавите на нее кончиком параллельных пинцетов. Если кость прогибается под давлением, переходите к следующему шагу.

Добавьте каплю физиологического раствора и, используя кончик скальпеля, ориентированный горизонтально, приподнимите костный лоскут. Осторожно удалите лоскут с помощью пинцета, чтобы избежать отрыва оставшейся части кости. После обнажения поверхности обонятельной луковицы убедитесь в отсутствии кровотечения или кровеносных сосудов.Анастомоз.

Протрите область желатиновой губкой, смоченной в физиологическом растворе. Чтобы поддерживать увлажненность обонятельной луковицы, нанесите полиакрилатный стоматологический цемент с помощью шприца 29G, чтобы сформировать вокруг краниального окна бортик на кости. Капните каплю низкоплавкого agarose на твердую мозговую оболочку и накройте краниальное окно стерильным покровным стеклом для проведения визуализации.

Поместите стереотаксическую раму под стереомикроскоп, центрируя краниальное окно в поле зрения, и настройте фокус, чтобы капилляры стали видны. Переключитесь на зеленый свет с длиной волны 580 нанометров и сделайте анатомическое контрольное изображение для проверки состояния препарата во время визуализации. Затем приступите к записи стимуляционных проб, используя либо визуализацию внутренних оптических сигналов при освещении 630 нанометрами, либо визуализацию автофлуоресцентного сигнала флавопротеинов при освещении 480 нанометрами. Стандартный сеанс визуализации включает базовую линию продолжительностью от 5 до 10 секунд, в течение которой подается только воздух, с последующей стимуляцией запахом в течение от 3 до 10 секунд в зависимости от выбранной концентрации запаха.

И наконец, для записи базового восстановления регистрируется подача воздуха в течение 70–82 секунд. В этот момент через краниальное окно визуализируется сосудистая сеть обонятельной луковицы, после чего следуют результаты пробного стимулирования с использованием h-сигнала в качестве одоранта, зафиксированные с помощью методов визуализации iOS и FAS. При использовании визуализации iOS активность, вызванная запахом, отображается в виде темных зон поглощения; области, активированные AL, отмечены белыми стрелками; активные зоны видны как в отдельных, так и в усредненных по нескольким пробам испытаниях.

При переключении на FAS-визуализацию активность, вызванная стимуляцией той же самой мыши OD, теперь отображается в виде белых областей автофлуоресцентного излучения, отмеченных черными стрелками; она также наблюдается как в одиночных, так и в усредненных по нескольким попыткам испытаниях. Обратите внимание, что черные зоны поглощения, видимые при iOS-визуализации, и белые области автофлуоресцентного излучения, видимые при FAS-визуализации, перекрываются. Это пространственное совпадение подтверждает, что оба метода позволяют визуализировать одни и те же обонятельные клубочки. После освоения процедуры визуализация вызванной активности с использованием сигналов оптического отражения и автофлуоресценции может быть выполнена за один час хирургического вмешательства и несколько часов сбора изображений.

Основными недостатками использования данных методов оптической визуализации являются тот факт, что они не могут быть применены для визуализации обонятельных карт у свободно передвигающихся мышей. Кроме того, из-за ограниченного проникновения фотонов в биологические ткани они не позволяют получить доступ к вентральным обонятельным клубочкам после их развития в конце девяностых при регистрации внутренних сигналов в обонятельной системе. Возможно, это станет путем для исследователей в области оптической визуализации для изучения характеристик специального покрытия од.

Визуализация автофлуоресценции флавопротеинов в обонятельной луковице является перспективным методом, позволяющим по-новому взглянуть на особенности покрытия OD, используя эндогенные оптические сигналы.