Выделение лабильной Multi-белковые комплексы по В естественных условиях Контролируемые Сотовая сшивания и иммуно-магнитного аффинной хроматографии
9 марта 2010 г.
Ячейки проницаемыми сшивателя DSP [дитиобис-(сукцинимидил пропионат)] стабилизирует переходных и лабильной взаимодействия В естественных условиях, Что позволяет их изоляции использованием строгих белковый комплекс методов очистки. Здесь мы представляем технику для сшивания клетки, выращенные в культуре с последующим выделением белковых комплексов, иммунопреципитацией.
Для сшивания с последующим иммунопреципитированием клетки при плотности 80–90% инкубируют с 1 мM ледяным раствором DSP в PBS, содержащем только кальций, магний или DMSO.
Контроль носителя. DSP представляет собой гомобифункциональный мембранопроницаемый восстановимый кросслинкер, который связывает свободные группы, находящиеся на расстоянии до 12 angstroms друг от друга. После кросслинкинга клетки лизируют и проводят иммунопреципитацию с использованием стандартных контролей.
Затем белковые комплексы разделяют с помощью восстанавливающего электрофореза в ПААГ с SDS; восстанавливающие агенты расщепляют DSP, что позволяет идентифицировать отдельные белки методом иммуноблоттинга. Здравствуйте, я Стефани Ик из лаборатории доктора Виктора Фонде с кафедры клеточной биологии Университета Эмори. А я Перл Райдер, также из лаборатории Фонде.
Сегодня мы продемонстрируем процедуру выделения белковых комплексов с использованием контролируемого кросс-линкинга с последующей иммуномагнитной аффинной хроматографией. Мы используем этот метод в нашей лаборатории для изучения транзиторных лабильных белковых взаимодействий. Итак, приступим.
Начните с маркировки нижней части планшетов с клетками, указав тип клеток и конкретные экспериментальные условия. Положительный символ здесь указывает на обработку DSP, включая отрицательный контрольный образец только с растворителем DMSO. Добавьте среду в планшеты, чтобы подготовить их к посеву клеток.
Клетки HEK высевают в разведении от 1 до 5, чтобы обеспечить выделение 500 µg белка на одну стандартную пробирку реакции. Содержимого одной пробирки может быть достаточно для идентификации предполагаемых партнеров по связыванию интересующего белка с помощью иммуноблоттинга на основе масс-спектрометрического анализа. Увеличьте количество стандартных реакций как минимум в 10 раз.
Также подготовьте запасы большинства растворов, используемых в эксперименте по кросс-линкингу. К ним относится PBS с добавлением 0,1 millimolar хлорида кальция и one millimolar хлорида магния, называемый PBS calcium magnesium. Добавление ионов кальция и магния имеет решающее значение для адгезии клеток к культуральной пластине.
В ходе эксперимента храните раствор при температуре 4 °C. Другие запасы включают раствор для гашения сшивающего агента, 50X коктейль из полных ингибиторов протеаз, который перемешивают на вортексе каждые 20 минут до полного растворения осадка, 20% Tritan X 100, который хранится при температуре 4 °C и должен быть использован в течение одного месяца, а также буферные растворы A в концентрациях 10x и 1x.
Приготовьте и храните все растворы в соответствии с подробными инструкциями, приведенными в прилагаемом письменном протоколе. В завершение приготовьте лизирующий буфер, состоящий из одного X буфера A и 0,5% TRITTON X 100, а также буфер для иммуномагнитного осаждения или IP-буфер, состоящий из одного X буфера.
Добавьте 0,1% TRITTON X 101; через два дня после посева клетки достигают 80–90% конфлюэнтности, что является оптимальным для сшивания. В условиях высокой конфлюэнтности клетки имеют тенденцию накладываться друг на друга, что приводит к снижению доступности проникающего в клетку сшивающего агента для всех клеток. Поместите планшеты обратно в инкубатор до начала процедуры сшивания.
Приготовьте раствор кросслинкера DSP непосредственно перед нанесением на клетки. DSP обладает высокой гидрофобностью и поэтому сначала растворяется в DMSO до концентрации 100 millimolar, после чего разбавляется в PBS кальций-магниевом буфере. Для улучшения растворимости DSP в PBS кальций-магниевом буфере добавьте 10 microliters стокового раствора DSP в DMSO в предварительно подогретый соответствующий объем буфера.
На каждый миллилитр подогретого PBS с кальцием и магнием по каплям добавляйте стоковый раствор D-S-P-D-M-S-O, постоянно перемешивая до полного растворения DSP. Также приготовьте контрольный раствор растворителя, содержащий 10 µL DMSO на каждый миллилитр PBS с кальцием и магнием. После разведения DSP держите все растворы PBS с кальцием и магнием в ледяной бане не более 10 минут.
Затем подготовьте ледяную водяную баню, в которой будут находиться все планшеты, используемые в эксперименте. Извлеките культуральные планшеты с клетками из инкубатора при 37 °C и немедленно поместите их в ледяную водяную баню. Промойте клетки дважды ледяным PBS с содержанием кальция и магния, используя те же объемы, которые были подготовлены ранее для инкубации с кросслинкером: для 6-луночного планшета рассчитайте 2 мл на лунку и так далее.
После второй промывки добавьте к клеткам либо контрольный раствор (DMSO, растворенный в буфере), либо раствор буфера для кросс-линкинга DSP; инкубируйте на льду в течение двух часов, проверяя состояние образцов примерно каждые 20 минут, чтобы убедиться, что все клетки покрыты раствором. Если некоторые клетки окажутся открытыми, наклоните и поверните чашку, чтобы снова равномерно распределить раствор; выпадение небольшого количества осадка DSP является нормальным явлением.
В течение двухчасовой инкубации клеток, до окончания этого периода, приготовьте 1X раствор для гашения DSP, разбавив сток в PBS с кальцием и магнием. Держите раствор на льду до момента остановки реакции кросс-линкинга путем инактивации не вступившего в реакцию DSP. По истечении двух часов удалите с клеток контрольный раствор (плацебо) и растворы для кросс-линкинга.
Добавьте ледяной раствор для гашения DSP и инкубируйте на льду в течение 15 минут. Тем временем разведите стоковый коктейль из полных ингибиторов протеаз в буфере для лизиса клеток в соотношении 1:50. По истечении 15 минут дважды промойте клетки фосфатно-солевым буфером (PBS) с кальцием и магнием.
Затем добавьте к клеткам лизирующий буфер, содержащий ингибиторы протеаз, и перемешивайте на качалке при температуре 4 °C в течение 30 минут. По истечении 30 минут лизиса клеток соберите клетки с планшета с помощью скребка для клеток. Обязательно держите лизаты на льду, чтобы минимизировать активность протеаз.
Центрифугируйте клеточные лизаты в течение 15 минут при температуре четыре градуса Цельсия в настольной мини-центрифуге на максимальной скорости 15 000 Gs. Перенесите супернатант в новую пробирку с помощью пипетки, а осадок удалите. Проанализируйте уровни белка с помощью метода Брэдфорда и перейдите к иммунопреципитации. Начните подготовку к иммунопреципитации сразу после запуска двухчасовой реакции кросс-линкинга в микроцентрифужных пробирках с завинчивающимися крышками.
Смешайте 30 µL иммуномагнитных частиц anti IgG с 500 µL буфера для IP. Добавьте антитела к интересующему мишеневому белку. Оптимальное количество антител следует определить индивидуально для каждого антигена.
В предварительных экспериментах в качестве возможных отрицательных контролей для гранул можно использовать образцы без антител, только гранулы или гранулы с изотипическим контрольным антителом для связывания антитела IP с магнитными гранулами. Инкубируйте на перевернутом ротаторе в течение двух часов при комнатной температуре. По окончании инкубации кратковременно центрифугируйте пробирки и поместите их в магнитный держатель. Гранулы сконцентрируются у стенки магнита.
Удалите раствор, содержащий несвязавшиеся антитела, и немедленно промойте гранулы, чтобы предотвратить их высыхание. После двух промывок добавьте в соответствующие пробирки 500 µL клеточного лизата DSP-отрицательных или DSP-положительных клеток в концентрации 1 µg/mL. На этом этапе можно подготовить отрицательный контроль с конкурентным связыванием пептида, добавив в смесь лизата и гранул иммуногенный пептид в концентрации, определенной в ходе предварительных экспериментов.
Другим возможным отрицательным контролем, который можно подготовить на данном этапе, является реакционная смесь, содержащая только буфер или лизат-свободная реакция, которая готовится путем добавления только 500 µL лизирующего буфера к гранулам. Осторожно ресуспендируйте гранулы для экспериментальных и контрольных реакций. Не используйте вортекс, так как это приведет к разрушению гранул; инкубируйте при 4 °C с перемешиванием методом вращения («end-over-end») в течение двух часов.
По истечении двух часов удалите лизат с помощью магнитного держателя. Кратковременно центрифугируйте и промойте гранулы в общей сложности шесть раз, используя по 1 mL буфера для IP. Каждую промывку инкубируют при температуре 4 °C в течение пяти минут.
Для элюирования связанных комплексов добавьте один x буфер для образцов геля в пробирку с иммунопреципитатом непосредственно над осадком гранул. Чтобы собрать гранулы на дне пробирки, осторожно постучите по дну пробирки, чтобы все гранулы ресуспендировались в буфере для образцов геля. В качестве альтернативы, для иммуноаффинного выделения добавьте к гранулам 30 µl буфера A, дополненного иммуногенным пептидом.
Необходимая концентрация иммуногенного пептида определяется эмпирическим путем. После тестирования диапазона от 10 до 200 мкМ инкубируйте гранулы при температуре четыре градуса в течение двух часов, постукивая по пробиркам каждые 30 минут. Используйте магнитный держатель, чтобы удалить 30 мкл, содержащих элюированные комплексы, и перенесите их в чистую пробирку; промойте гранулы буфером для иммунопреципитации и сохраните их.
Добавьте один x буфер для образцов геля к бусинам для обоих методов элюции. Нагрейте иммуномагнитные бусины, ресуспендированные в буфере для образцов геля, при 75 °C в течение пяти минут для денатурации белков. Этот этап также приведет к расщеплению молекулы DSP, что позволит разделить отдельные белки комплекса при электрофорезе.
Образцы на геле SDS-ПАГ для вестерн-блоттинга. Очищенные иммуномагнитные бусины можно осадить центрифугированием и удалить из образца с помощью магнитного держателя перед нанесением. Если иммуноаффинная EUA не содержит IgG (что подтверждается окрашиванием белков на SDS-ПАГ или иммуноблоттингом), она пригодна для масс-спектрометрии.
Ниже представлен пример вестерн-блоттинга материала из сшитого и несшитого клеточного лизата с последующим иммуномагнитным осаждением с использованием моноклонального антитела к субъединице AP3. Сшивание позволяет обнаружить взаимодействующие белки, которые не выявляются в несшитых образцах при иммуномагнитном выделении. Отрицательные контроли не показали специфического осаждения белков при использовании контролей без антител и изотипического контроля с IgG против рецептора трансферрина как для несшитых, так и для сшитых образцов.
В данном примере для восстановления белков, связавшихся с антителом при ИП, использовалась аффинная элюция пептидом. Обратите внимание, что иммуноантитело отсутствует во фракции супернатанта и остается во фракции осадка во время элюции пептидом. Мы только что продемонстрировали вам способ изоляции лабильных комплексов MultiPro с помощью химического кросслинкера DSP с последующей иммуномагнитной аффинной очисткой.
При выполнении данной процедуры важно поддерживать низкую температуру растворов клеток и лизатов, чтобы сохранить лабильные взаимодействия во время кросс-линкинга и минимизировать активность протеаз. На этом всё. Спасибо за просмотр и удачи в ваших экспериментах.
Просмотрите полный транскрипт и получите доступ к тысячам научных видео
Обзор
В данной статье представлен метод сшивания клеток с помощью DSP — проникающего в клетки кросслинкера — для стабилизации транзиторных белковых взаимодействий in vivo. Этот метод позволяет выделять белковые комплексы с помощью иммунопреципитации.
Основные компоненты исследования
Область науки
- Нейронаука
- Клеточная биология
- Белковые взаимодействия
Теоретическая часть
- DSP представляет собой гомобифункциональный мембранопроницаемый кросслинкер.
- Он создает перекрестные связи между белками, находящимися на расстоянии до 12 ангстрем друг от друга.
- Данный метод расширяет возможности изучения транзиторных белковых взаимодействий.
- Иммунопреципитация является стандартным методом выделения белковых комплексов.
Цель исследования
- Разработать надежный метод сшивания белков в культивируемых клетках.
- Облегчить изоляцию белковых комплексов для последующего анализа.
- Углубить понимание белковых взаимодействий in vivo.
Используемые методы
- Клетки инкубируют с 1 mM DSP в PBS или DMSO.
- После кросс-линкинга клетки подвергают лизису.
- Иммунопреципитацию проводят с использованием стандартных контролей.
- Белковые комплексы изолируют для последующего анализа.
Основные результаты
- Метод сшивки эффективно стабилизирует белковые взаимодействия.
- Изолированные белковые комплексы можно анализировать с помощью методов строгой очистки.
- Данный подход позволяет изучать транзиторные взаимодействия в контролируемой среде.
- Результаты демонстрируют полезность DSP в исследовании белковых комплексов.
Выводы
- Метод кросс-линкинга с использованием DSP является ценным инструментом для исследователей.
- Он расширяет возможности изучения белковых взаимодействий in vivo.
- Этот метод может дать новые представления в области клеточной биологии и нейронаук.
Часто задаваемые вопросы
Практическая значимость для отрасли
Выделение лабильных мультибелковых комплексов с использованием перекрестного связывания in vivo и иммуномагнитной аффинной хроматографии позволяет восполнить критический пробел в регистрации транзиторных или слабых белковых взаимодействий, лежащих в основе работы клеточных механизмов. Эта возможность повышает прогностическую достоверность при валидации мишеней и снижении механистических рисков на ранних этапах поиска и в предоклинических точках принятия решений. Данный метод способствует принятию обоснованных решений по формированию портфеля препаратов, позволяя идентифицировать белковые сети, которые иначе недоступны при использовании стандартных протоколов очистки.
Стратегические применения в биофармацевтических исследованиях и разработках
Первичный поиск и валидация мишени
- Стабилизирует транзиторные белковые взаимодействия для выяснения функциональных белковых сетей вокруг интересующих мишеней.
- Обеспечивает механистическое снижение рисков за счет захвата слабых или динамических ассоциаций, имеющих решающее значение для изучения путей.
- Повышает прогностическую уверенность при валидации мишени, предоставляя доступ к комплексам, которые в иных условиях являются лабильными.
Скрининг и разработка анализа
- Подготовка валидированных белковых комплексов для последующего анализа методом иммуноблоттинга или масс-спектрометрии.
- Обеспечение стандартизации анализа за счет воспроизводимой изоляции белковых ансамблей.
- Возможность количественной оценки белок-белковых взаимодействий для надежной оценки соединений.
Трансляционные и доклинические исследования
- Соответствует целям поиска трансляционных биомаркеров за счет сохранения нативных белковых комплексов для их последующей идентификации.
- Обеспечивает преемственность от этапа открытия до доклинической валидации, поддерживая изучение сетей белков, имеющих значение для патогенеза заболевания.
- Снижает биологические риски в доклинических моделях, гарантируя обнаружение физиологически значимых взаимодействий.
Интеграция конвейеров и рабочих процессов
Данный метод интегрируется в процесс исследований — от первоначальной проверки гипотез до идентификации перспективных соединений и доклинических исследований, обеспечивая надежную характеристику белковых комплексов на каждом этапе.
- Открывательная биология: способствует проверке гипотез и уточнению путей за счет стабилизации и изоляции лабильных белковых ансамблей.
- Скрининг: обеспечивает воспроизводимые количественные результаты, подходящие для последующего иммуноблоттинга и масс-спектрометрического анализа.
- Аналитика: предоставляет измеримые показатели состава белковых комплексов, что позволяет проводить сравнительный анализ при различных экспериментальных условиях.
- Трансляционные исследования: сохраняет значимые для заболевания комплексы для сопоставления биомаркеров и доклинической валидации.
- Корпоративное повторное использование: предлагает масштабируемую, адаптируемую платформу для многократного использования с различными мишенями и клеточными системами.
Операционное и корпоративное воздействие
- Научная ценность: повышает прогностическую достоверность и снижает механистическую неопределенность при валидации мишеней.
- Операционная ценность: стандартизирует изоляцию белковых комплексов, улучшая воспроизводимость и масштабируемость.
- Стратегическая ценность: позволяет принимать обоснованные решения о продолжении или прекращении разработки (go/no-go) и снижает биологические риски на поздних этапах.
- Влияние на портфель: поддерживает приоритизацию с учетом рисков и продвижение программ по поиску новых лекарственных средств.
Особенности реализации
- Требуются экспертные знания в области химии белков, иммунопреципитации и аналитических методов, таких как вестерн-блоттинг и масс-спектрометрия.
- Необходим доступ к реагентам для кросс-линкинга, платформам на основе магнитных бусин и инфраструктуре холодовой цепи для сохранения образцов.
- Требуется строгая стандартизация контролей и аналитических протоколов между исследовательскими группами.
- Метод применим к различным системам cultured cell, однако может потребовать эмпирической оптимизации для каждой конкретной мишени или модели.
- Возможности метода ограничены взаимодействиями в пределах спейсерной группы кросс-линкера, что может привести к тому, что не все значимые ассоциации будут зафиксированы.
