Экспериментальные Пробирной метастазы

Общая цель следующего эксперимента заключается в проверке метастатического потенциала раковых клеток человека с помощью инъекций в хвостовую вену. В иммунодефицитных мышах подготавливаются клетки для инъекции. Затем клетки вводят иммунодефицитным мышам, у которых через один-два месяца развиваются метастазы в легких.

Мышей подвергают диссекции, после чего количественно определяют и культивируют метастазы в легких. Результаты данного типа анализа указывают на степень метастазирования конкретного типа раковых клеток. Здравствуйте, я Сонали Моханти из лаборатории доктора LE факультета биомедицинской генетики Рочестерского университета.

Сегодня мы продемонстрируем процедуру проведения экспериментального анализа метастазирования. Мы используем этот метод в нашей лаборатории для изучения метастазирования рака. Итак, приступим.

Начните с клеток, выращенных до примерно 70% конфлюэнтности; аспирируйте среду из планшета и осторожно промойте один раз 1×PBS. Затем добавьте два миллилитра 0,05% трипсина. Осторожно покачайте планшет, чтобы облегчить открепление клеток.

Наблюдайте за клетками под микроскопом в процессе их открепления. Добавьте достаточный объем среды с FBS для нейтрализации действия трипсина. Затем перенесите суспензию в пробирку объемом 50 мл.

Подсчитайте количество клеток с помощью гемоцитометра. После определения концентрации центрифугируйте пробу при ускорении около 200 ×g в течение трех минут, стараясь не потревожить осадок клеток. Осторожно удалите среду и ресуспендируйте осадок в соответствующем объеме сбалансированного солевого раствора Хэнкса (HBSS) для достижения конечной концентрации примерно 5 × 10⁶ клеток/мл.

Затем профильтруйте суспензию через клеточный фильтр Falcon с размером пор 70 мкм. Чтобы исключить крупные клеточные агрегаты, поместите кончик пипетки непосредственно на фильтр, установленный на культуральной пробирке объемом 5 мл. Быстро вытесните суспензию через фильтр в пробирку.

Повторно подсчитайте количество клеток, используя трипановый синий, для определения жизнеспособности. Перед инъекцией жизнеспособность должна составлять более 90%. Затем разведите суспензию до конечной концентрации 2,5 × 10⁶ клеток на мл.

Хранить на льду. Осторожно возьмите иммунодефицитную мышь за хвост и поместите ее в фиксатор так, чтобы спина была прижата к прорези, а хвост выступал из небольшого отверстия сзади. Медленно сдвиньте кольцо внутрь вдоль прорези.

Когда кольцо зафиксирует рот мыши, закрепите его. Мышь не должна иметь возможности свободно двигаться, но при этом должна сохранять нормальную частоту дыхания. Найдите основные хвостовые вены.

В хвосте мыши расположены четыре основных кровеносных сосуда. Артерии находятся на дорсальной и вентральной сторонах хвоста. Вены расположены с латеральных сторон.

Наберите не менее 200 µL подготовленной клеточной суспензии в шприц объемом 1 мл. Установите иглу калибра 30 G и удалите все пузырьки воздуха. Конечный объем в шприце должен составлять 200 µL.

Подготовьтесь к инъекции в дистальный конец хвоста. Таким образом, если первая попытка окажется неудачной, для повторной инъекции можно будет использовать более проксимальный отдел хвоста. После протирания места инъекции 70% ethanol выпрямите хвост.

Удерживайте наконечник большим пальцем, поддерживая место инъекции указательным пальцем. Введите иглу в вену и введите клетки. Во время инъекции следите за тем, чтобы игла и шприц были параллельны вене.

В противном случае игла проткнет стенку сосуда, и клетки будут введены в прилегающие ткани хвоста. Извлеките иглу, если процедура прошла успешно. Из места инъекции должна начать сочиться кровь.

Прижмите чистый ватный тампон, чтобы облегчить удаление остатков препарата, и пальпируйте хвост в направлении к телу, чтобы протолкнуть остатки образца в кровоток. Освободите мышь из фиксатора и верните её в клетку. Запишите количество попыток инъекции и количество введенных клеток в лабораторный журнал.

Определите жизнеспособность клеток после инъекции. Как и прежде, этот этап позволяет убедиться, что клетки остаются живыми на протяжении всего процесса инъекции. По завершении эксперимента по инъекции жизнеспособность клеток снизится, но должна оставаться выше 80%. В качестве дополнительного этапа осадите оставшиеся клетки центрифугированием и один раз промойте осадок раствором PBS.

Затем заморозьте осадки при температуре −80 °C для последующих анализов, таких как вестерн-блоттинг. Для подтверждения экспрессии генов при нокдауне через один-два месяца проведите диссекцию мышей для определения локализации метастазов. Начните с размещения эвтаназированной мыши на диссекционном столе.

Обильно опрыскайте мышь этанолом. Вскройте грудную клетку, чтобы обнажить легкие и сердце. Затем аккуратно извлеките их и поместите в PBS.

Легкие являются основным местом метастазирования, так как они содержат первое капиллярное русло, с которым сталкиваются клетки. После их попадания в кровоток удалите сердце и промойте легкие в PBS, затем осмотрите каждую долю легкого под диссекционном микроскопе. Подсчитайте количество обнаруживаемых метастазов с обеих сторон легких, затем суммируйте количество метастазов во всех четырех долях, чтобы определить общее число метастазов в легких.

Затем с помощью ножниц путем иссечения изолируйте отдельные метастазы в легких. Перенесите каждую метастазу в клеточный фильтр с размером пор 70 µm и измельчите ее концом стерильного колпачка иглы. Промойте фильтр несколькими миллилитрами среды и соберите клетки, прошедшие через фильтр.

В чашку для культивирования помещают клетки одного метастаза (в каждую чашку — клетки отдельного метастаза). Инкубируют клетки при 37 °C в течение не менее четырех дней, не тревожа культуру. Первоначально на планшетах будут расти как раковые клетки, так и фибробласты, но постепенно фибробласты погибнут, и их место займут раковые клетки.

Если раковые клетки несут гены устойчивости к определенным препаратам, проведите селекцию клеток с помощью соответствующих антибиотиков. Через три дня удалите остатки крови или тканей с чашки путем промывания PBS и добавьте свежую среду. Оцените чистоту полученных клеток с помощью иммуноокрашивания антителами к специфическим человеческим белкам; в данном случае антитела против человеческих белков используются даже при отсутствии селекции препаратами. Доля человеческих клеток должна составлять более 99%.

Полученные клетки теперь можно повторно ввести иммунодефицитным мышам, чтобы в конце данного анализа проверить их метастатический потенциал. Высокометастатическая линия раковых клеток обычно приводит к образованию многочисленных метастазов в легких, в то время как при использовании низкометастатической линии таких метастазов будет очень мало. На этих изображениях показаны метастазы в легких через два месяца после инъекции линии клеток меланомы человека.

A 3 7 5 sm. Клетки, полученные этим методом, обычно при тестировании дают больше метастазов, чем родительская линия. Таким образом, с помощью данного анализа мы продемонстрировали вам процедуру проведения экспериментального анализа метастазирования.

При выполнении данной процедуры крайне важно следить за тем, чтобы клетки вводились именно в хвостовую вену, а не в окружающие ткани хвоста. На этом все. Спасибо за просмотр и удачи в ваших экспериментах.