Экспериментальные метастазы и CTL Приемные Передача Иммунотерапия мышиной модели

Общая цель данной процедуры — изучить эффективность иммунотерапии in vivo с использованием адоптивного переноса опухоль-специфических T-клеток. Сначала для создания метастазов в легких мышам проводят трансплантацию опухолевых клеток путем инъекции в латеральную хвостовую вену. Вторым этапом процедуры является лечение мышей с опухолями с помощью опухоль-специфических цитотоксических T-лимфоцитов CTLs.

Заключительным этапом является использование туши «India ink» для визуализации и количественной оценки опухолевых узлов. В конечном итоге можно получить результаты, демонстрирующие эффективность ингибирования канцерогенеза (CIE) при различных вариантах лечения путем измерения размера опухоли и подсчета количества опухолевых узлов. Здравствуйте, меня зовут Мэри Циммерман, я сотрудник лаборатории доктора Кевина Лу в Медицинском колледже Джорджии.

Здравствуйте, меня зовут Шелин Ху. Я студентка второго курса, а также работаю в лаборатории доктора Лу. Основным преимуществом данного метода по сравнению с традиционными способами, такими как кривые выживаемости, является то, что эта процедура носит как качественный, так и количественный характер. Значение этих методов может распространяться на терапию рака, так как они имитируют адоптивную иммунотерапию Т-клетками у пациентов с онкологическими заболеваниями.

Итак, приступим. За день до инъекций опухолевых клеток засейте один флакон T 75, используя до 1 × 10⁷ клеток CMS4met в 10 мл среды RPMI с 10% сыворотки. Чтобы получить быстрорастущие опухолевые клетки, инкубируйте их в течение ночи при 37 °C перед днем инъекции.

Удалите среду и один раз промойте клетки PBS, затем соберите клетки опухоли с помощью 0,05% трипсин-ЭДТА при 37 °C в течение пяти минут. Остановите реакцию, добавив 10 мл среды RPMI, содержащей 10% сыворотки. Перенесите клетки в коническую пробирку.

Центрифугируйте клетки при 1300 RPM в настольной центрифуге при комнатной температуре в течение трех минут. При комнатной температуре удалите супернатант, ресуспендируйте клетки в 10 миллилитрах свежего 1X HB Ss для промывки. Затем повторно центрифугируйте и ресуспендируйте клетки аналогичным образом.

Подсчитайте количество опухолевых клеток с помощью hemo.Cytometer. Разведите клетки в HBSS таким образом, чтобы ресуспендировать количество клеток, необходимое для каждой инъекции. Мышей B SEA в возрасте от шести до восьми недель в общем объеме 100 микронлитра прогрейте в стакане, погруженном в теплую воду.

Для расширения хвоста поместите мышь в фиксатор для хвоста на лабораторном столе. С помощью микрошприца введите 100 µL опухолевых клеток в латеральную вену хвоста. Соблюдайте правила асептики, чтобы избежать инфицирования после инъекции.

Оказывайте легкое давление на место инъекции до остановки кровотечения. Верните мышь в клетку и дождитесь достижения опухолью нужной стадии роста. В день переноса несколько раз перемешайте суспензию с помощью пипетки, чтобы ресуспендировать подготовленные очищенные цитотоксические Т-лимфоциты или CTL.

Как описано в тексте, перенесите все клетки из одной чашки в коническую пробирку объемом 15 мл, следя за тем, чтобы объем не превышал двух третей пробирки. Вставьте стерильную пипетку Пастера в коническую пробирку и осторожно добавьте среду для разделения лимфоцитов (LSM) поверх клеток, пока общий объем не приблизится к 14 мл.

Будьте осторожны, чтобы не нарушить разделение слоев. Центрифугируйте при 2000 RPM в течение 20 минут при комнатной температуре. Не используйте тормоз для остановки ротора после центрифугирования, перенесите CTL в новую коническую пробирку объемом 15 миллилитров.

Добавьте HBSS до достижения объема приблизительно 10 мл. Для промывки центрифугируйте клетки при 1300 об/мин в течение пяти минут при комнатной температуре. Ресуспендируйте осадок в HBSS до достижения плотности клеток, необходимой для инъекций.

Поддерживайте общий объем за одну инъекцию на уровне 100 µL. Используйте ту же технику инъекции в хвост, которая была продемонстрирована ранее в этом видео. Чтобы ввести CTL в мышей с опухолью, верните мышь в клетку и дайте CTL вступить во взаимодействие с опухолью.

Мышей обычно подвергают эвтаназии для последующего анализа через 14–21 день после введения CTL. Для визуализации метастазов в легких положите мышь на спину на пенопластовую доску. Закрепите конечности булавками, чтобы обеспечить беспрепятственный доступ к трахее.

Опрыскайте вентральную сторону 70% ethanol, начиная от середины брюшка. С помощью ножниц сделайте разрез по срединной линии через грудную клетку вверх по направлению к слюнным железам. Обнажите трахею.

С помощью пинцета удалите ткани, окружающие трахею. Проденьте наконечник пипетки объемом 200 мкл под трахею, удерживая наконечник одной рукой. Осторожно приподнимите трахею вверх, отделяя ее от тела.

Поверните платформу на 180 градусов. Используя шприц объемом 50 milliliter, введите тушь из Индии в легкие через трахею. Полностью заполните легкие тушью до появления сильного сопротивления.

С помощью ножниц перережьте трахею. Просуньте пинцет под легкие и извлеките их из организма мыши. Кратковременно промойте легкие в стакане с водой объемом один литр в вытяжном шкафу.

Перенесите легкие в стеклянный флакон, содержащий пять миллилитров раствора FTI. Опухолевая ткань будет выглядеть в виде белых узелков на черном фоне легких. Через несколько минут можно будет подсчитать количество опухолей, после чего образцы можно хранить в растворе FTI неограниченное время.

Легкие мышей с трансфекцией клетками карциномы молочной железы. Линия клеток 4T1 имеет белые пятна, указывающие на опухоли. Мыши, трансфецированные доминантно-отрицательным мутантом IRF8 K79E, демонстрируют повышенный метастатический потенциал опухолевых клеток.

На этих изображениях представлен гистологический анализ эффективности иммунотерапии путем адаптивного переноса CTL. У мышей с опухолью, которым вводили физиологический раствор, спустя шесть дней наблюдалось множество опухолей, отмеченных стрелками. С другой стороны, у мышей, которым вводили опухолеспецифические Т-клетки, в том же эксперименте наблюдалось уменьшение количества опухолей.

Обработка индийскими чернилами представляет собой более простой способ оценки эффективности адаптивного переноса CTL. В данном случае белые опухолевые узлы на пораженных легких позволяют четко отличить их от легких, в которых адаптивный перенос CTL прошел успешно, а подсчет узлов обеспечивает степень количественной оценки, недоступную при гистологическом анализе. При выполнении этой процедуры важно не забывать предварительно согреть мышей для более легкого и точного введения препаратов в хвостовую вену.

После просмотра этого видео вы должны хорошо понимать, как оценивать эффективность лечения с помощью этой простой процедуры по количественному определению размера и числа опухолей. Благодарим за просмотр и желаем удачи в ваших экспериментах.