Иммуноцитохимическая Анализ стволовых клеток человека плюрипотентных использованием Self-Made цитоспина аппарата

Здравствуйте, меня зовут Рик Паскуа, я студент лаборатории инженерии стволовых клеток кафедры химических и биологических наук Университета Вирджинии в কমনвельте. В этом видео я продемонстрирую, как в нашей лаборатории используется недорогое устройство для центрифугирования STO собственной сборки для создания наблюдаемого монослоя плюрипотентных стволовых клеток человека с целью количественного определения маркеров клеточной поверхности. Поскольку многие иммунохимические протоколы адаптированы для hPSC, выращиваемых в камерных стеклах в виде колоний, при характеристике экспрессии биомаркеров на уровне отдельных клеток могут возникнуть определенные сложности.

Расположение клеток в монослое облегчает не только их визуальный анализ, но, возможно, и количественную оценку их экспрессии. Прибор для создания «синуса» (sinus spin apparatus), используемый в наших лабораториях, может быть сконструирован из материалов, имеющихся в большинстве лабораторий; для его работы требуется лишь небольшой образец клеток и не требуется никаких специфических реагентов. И что более важно, он позволяет надежно воспроизводить распределение одиночных клеток для наблюдения. Ниже приведен список материалов, необходимых для сборки этого устройства.

Пластиковые предметные стекла — поскольку они не обязательно должны быть идеально чистыми, при желании можно использовать старые стекла с камерой. Предварительно очищенные стеклянные предметные стекла. Их необходимо тщательно очистить, так как именно на них будет формироваться монослой клеток.

Фильтровальная бумага (подойдет любого типа) и наконечники для микропипеток. В нашей лаборатории перед началом сборки используются наконечники на 1–10 µL. Сначала в пластиковых предметных стеклах необходимо проделать отверстия.

Это можно выполнить с помощью сверлильного станка. Диаметр отверстий зависит от размера наконечника микропипетки и должен быть примерно равен ширине самой широкой части наконечника, используемого для стандартной микропипетки на 10 мкл. Этот размер составляет около семи миллиметров.

Количество отверстий, которые вы создаете в пластиковых предметных стеклах, полностью зависит от целей их использования. Например, для иммунохимического окрашивания в нашей лаборатории мы обычно используем два отверстия: одно для положительного окрашивания, другое — для отрицательного фонового контроля. Эти стекла могут использоваться повторно неограниченное количество раз.

Для подготовки фильтровальной бумаги просто вырежьте ее фрагмент по размеру пластикового предметного стекла. Используйте отверстия в стекле в качестве ориентира для создания отверстий в фильтровальной бумаге. Размер отверстия в фильтровальной бумаге должен быть достаточно большим, чтобы наконечник микропипетки плотно входил в него, как показано здесь.

Затем необходимо отрезать соответствующее количество наконечников для микропипеток — по одному для каждого отверстия, примерно на половине их длины. Они послужат основанием предметного стекла, на котором будет сформирован клеточный монослой. После этого сверху на них помещают фильтровальную бумагу.

Фильтровальная бумага будет служить для поглощения излишков среды при окрашивании суспензии. Сверху она будет накрыта пластиковым предметным стеклом, которое будет выполнять роль твердой опоры устройства. После этого конструкцию можно герметизировать со всех четырех сторон обычной бытовой клейкой лентой.

Наконец, в обрезанные кончики устройства вставляются цельные наконечники микропипеток. В них будут помещены клеточные образцы после окрашивания суспензии. Также может быть полезно заранее отметить на предметном стекле расположение обрезанных кончиков для более удобного их поиска.

Протокол иммунохимического окрашивания суспензии, используемый в нашей лаборатории, начинается со сбора стволовых клеток в виде суспензии одиночных клеток, что обычно осуществляется путем ферментативного воздействия с использованием трипсина или с помощью неферментативных буферов для диссоциации клеток на основе EDTA. Затем клетки переносят в микроцентрифужные пробирки объемом 1 мл или 2 мл в стандартную ростовую среду. После этого образцы центрифугируют при 200 G в течение четырех минут.

Для всех последующих этапов промывки и центрифугирования будет использоваться та же скорость центрифугирования. Затем среду удаляют с помощью ручного аспиратора; при аспирации следует соблюдать особую осторожность, чтобы не потревожить осадок клеток. После этого осадок дважды промывают 1 ml PBS, каждый раз центрифугируя и удаляя супернатант путем аспирации.

Следующий этап включает фиксацию клеток с помощью 4% формальдегида или PFA; реагенты, необходимые для этого, указаны в сопровождающем описании к данному видео. Клетки инкубируют в 4% растворе формальдегида при комнатной температуре в течение 10 минут. Рекомендуется выполнять этот этап перед приготовлением внеклеточной суспензии и окрашиванием при использовании цитоцентрифуги.

Затем клетки дважды промывают раствором PBS для удаления остатков PFA. После этого следует провести блокировку клеток для предотвращения неспецифического окрашивания. После промывок раствором PBS на предыдущем этапе аспирируйте промывочный раствор и добавьте 1 мл блокирующего раствора.

Затем образец следует оставить при комнатной температуре примерно на 45 минут. Пока идет процесс блокировки, можно подготовить первичные антитела, разведя их в блокирующем растворе до рекомендуемой концентрации. Храните этот раствор при температуре 4 °C.

После выдерживания клеток в блокирующем растворе в течение примерно 45 минут центрифугируйте их, аспирируйте раствор и перевзбейте клетки в растворе первичных антител. Для выявления неспецифического связывания и контроля фона рекомендуется оставить хотя бы один образец в качестве отрицательного контроля. В этом образце первичные антитела не применяются, и клетки просто ресуспендируют в PBS.

Все образцы выдерживают при комнатной температуре в течение примерно одного часа. При необходимости фиксированные клетки можно оставить в суспензии в растворе первичных антител на ночь, после чего их следует дважды промыть блокирующим раствором. Раствор вторичных антител можно приготовить во время проведения промывки.

Вторичные антитела обычно чувствительны к свету, поэтому, по возможности, следует приглушить свет в лаборатории и обернуть все используемые контейнеры алюминиевой фольгой; это необходимо для предотвращения выгорания флуоресценции. В протокол можно включить реагенты Antifa, однако при их использовании следует соблюдать осторожность, так как это может привести к повышению фона, аналогично случаю с первичными антителами, разведенными до рекомендуемой концентрации в блокирующем растворе. После завершения промывки нанесите один визуал на все образцы, независимо от того, добавлялись ли в них первичные антитела.

Оставьте образец в темном месте, например, внутри банки, примерно на один час. Дважды промойте клетки 1 мл блокирующего раствора. Теперь клетки готовы к окрашиванию ядер красителем DPI.

Сначала приготовьте раствор DPI в PBS в разведении 1:10 000, один раз промойте клетки в 1 ml PBS, затем ресуспендируйте их в растворе DPI и выдержите при комнатной температуре примерно от 5 до 10 минут. Как и вторичные антитела, DAPI чувствителен к свету, поэтому примите необходимые меры для предотвращения выгорания флуоресценции. Один раз промойте клетки в 1 ml PBS и в завершение снова ресуспендируйте.

Снова ресуспендируйте в 1 ml PBS. После этого образец будет готов для использования в цитоцентрифуге. Поместите не более 100 µl суспензии одиночных клеток в верхнюю часть наконечников микропипеток.

Однако рекомендуется использовать меньшее количество, чтобы предотвратить излишнее переливание или стекание. После этого поместите устройство для цитоцентрифугирования и противовес в настольную центрифугу и центрифугируйте при 1000 RPM в течение четырех минут. Затем осторожно разберите устройство для цитоцентрифугирования так, чтобы свести к минимуму вероятность смещения клеток со стеклянного предметного стекла.

Перед монтажом убедитесь в том, что произошло осаждение, используя флуоресцентный микроскоп. На представленных снимках изображен монослой клеток BG1V, окрашенных маркерами клеточной поверхности SSCA4, полученный с помощью центрифуги для подготовки мазков (цитоцентрифуги). Обратите внимание, насколько изолированы клетки друг от друга, что позволяет проводить наблюдения и запись данных для каждой отдельной клетки.

Преимущество данного протокола заключается в том, что он позволяет воспроизвести монослой клеток доступным и экономически выгодным способом, который легко адаптировать для любого рутинного анализа культур стволовых клеток. Надеюсь, что это видео было вам полезно и данный протокол окажется применимым в ваших собственных исследованиях.