Анализ плюрипотентных стволовых клеток с помощью Cryosections из эмбриоидные тела
8 декабря 2010 г.
Плюрипотентных стволовых клеток, растущих в виде суспензии дифференцироваться в эмбриоидных тел (ЭТ). Здесь показано, как получить высокое качество EB cryosections полезны для изучения клеточных и молекулярных аспектов эмбриогенеза, сохраняя при этом свою организацию как агрегаты.
Часть первая, Введение. Здравствуйте, меня зовут Рафаэль. Я постдок в лаборатории профессора Стивенса Ханса в Федеральном университете Рио-де-Жанейро в Бразилии.
Здравствуйте, меня зовут Исмаил. Я научный сотрудник, а также профессор. В этом видео мы покажем, как подготовить прозрачные срезы тел Android.
Итак, приступим. Часть вторая: материалы и оборудование. Для данной процедуры нам понадобится среда для заливки замороженных образцов.
4% раствор параформальдегида для фиксации клеток, растворы сахарозы для криопротекции. Игла со слегка изогнутым наконечником, стереомикроскоп для лучшей визуализации EBS и шейкер. Часть третья.
Здесь эмбриональные тельца человека культивируются в планшетах для неадгезивного культивирования. С помощью пипетки мы собираем все эмбриональные тельца как можно плотнее друг к другу, чтобы перенести их в коническую пробирку объемом 15 мл. EBS осторожно собирают и переносят в пробирку.
Важно собрать все тела эмбриональных стволовых клеток (ebs), так как количество материала невелико. После декантации EBS культуральная среда осторожно удаляется. В нижней части пробирки должен быть виден осадок. Теперь можно переходить к процедуре фиксации.
Эмбрионы (EBS) фиксируют в 4% растворе параформальдегида в PBS или фосфатно-солевом буферном растворе. Важно ресуспендировать осадок в растворе ПФА. Затем эмбрионы выдерживают в фиксирующем растворе в течение 30 минут.
После фиксации раствор PFA осторожно удаляют. Чтобы избежать ресуспендирования EBS, его заменяют 10% раствором сахарозы в PBS для начала криопротекции EBS; материал выдерживают в этом растворе в течение 30 минут. Затем осторожно удаляют 10% раствор сахарозы и ресуспендируют EBS в 20% растворе сахарозы.
Затем EBS снова выдерживают в этом растворе в течение 30 минут. В завершение 20% раствор сахарозы удаляют и заменяют 30% раствором сахарозы в PBS, в котором образцы выдерживают еще 30 минут. Теперь можно приступить к ориентации и блокировке EBS.
В нашей лаборатории в качестве форм используются пустые капсулы. Для блокировки ebs важно покрыть внутренние стенки наконечника раствором сахарозы перед сбором ebs. Теперь можно осторожно собрать EBS и подождать, пока они осядут на дно наконечника.
Затем EBS помещают в центр блока. Это должно быть окончательное положение EBS внутри блока. С помощью стереомикроскопа и тонкого наконечника мы собираем и удаляем как можно больше раствора сахарозы.
Постоянно следите за тем, чтобы не собрать эмбриональные стволовые клетки (ebs). С помощью иглы с слегка изогнутым кончиком все EBS перемещают в центр блока. В завершение остатки раствора сахарозы удаляют с помощью кусочков фильтровальной бумаги.
Точное расположение EBS внутри блока имеет решающее значение для получения срезов высокого качества. Здесь представлен пример неправильного размещения EB внутри оболочки. После позиционирования EBS и удаления раствора сахарозы оболочка заполняется OCT, начиная с краев, при этом необходимо постоянно следить за тем, чтобы Resus не привел к взвешиванию ebs.
Оставшиеся пузырьки удаляют с помощью пипетки, после чего образцы в раковинах перемешивают в течение 15 минут. После перемешивания блок в OCT замораживают на сухом льду.
На данном этапе вы можете либо хранить блок, обернутый в алюминиевую фольгу, при температуре -80 °C для дальнейшего анализа, либо перейти к части четыре — резке в криостате. Для изготовления криосрезов вам понадобятся одноразовый или многоразовый нож, OCT и стеклянные предметные стекла, предварительно обработанные поли-L-лизином. Блок OCT извлекают из морозильной камеры и выдерживают в криостате до достижения температуры -20 °C.
Затем блок помещают на штатив и выравнивают параллельно кромке ножа. Образцы EB значительно меньше большинства других образцов тканей, поэтому крайне важно убедиться, что вся поверхность блока касается ножа одновременно, чтобы свести к минимуму потерю материала. После позиционирования блок нарезают на срезы толщиной 10 micrometer, которые собирают непосредственно на предметные стекла.
Слайды можно хранить, предпочтительно при температуре минус 70 °C, или использовать в тот же день. Материал может быть окрашен для иммуногистохимического или иммунофлуоресцентного анализа. Заключение. Описанный здесь метод представляет собой достаточно недорогой и простой в исполнении протокол получения тонких криостат-срезов тел эмбрионов, развитых из линий стволовых клеток человека H9 или мыши USP1.
Полученные криосрезы могут быть использованы в самых разнообразных процедурах для анализа экспрессии белков или морфологии EB.
Просмотрите полный транскрипт и получите доступ к тысячам научных видео
Обзор
В данной статье продемонстрирован процесс получения высококачественных криосрезов эмбриоидных тел (ЭТ), полученных из плюрипотентных стволовых клеток, выращенных в суспензии. Эти криосрезы необходимы для изучения клеточных и молекулярных аспектов эмбриогенеза при сохранении структурной организации ЭТ.
Основные компоненты исследования
Область науки
- Биология стволовых клеток
- Эмбриогенез
- Клеточная дифференцировка
Теоретические основы
- Плюрипотентные стволовые клетки могут дифференцироваться в различные типы клеток.
- Эмбриоидные тельца представляют собой агрегаты, имитирующие раннее эмбриональное развитие.
- Изучение ЭТ помогает понять механизмы эмбриогенеза.
- Высококачественные криосрезы имеют решающее значение для детального анализа.
Цель исследования
- Представить метод подготовки криосрезов эмбриональных телец (ЭТ).
- Облегчить изучение клеточных и молекулярных процессов в ходе дифференцировки.
- Сохранить структурную организацию ЭТ при проведении анализа.
Используемые методы
- Подготовка плюрипотентных стволовых клеток в суспензионной культуре.
- Индукция дифференцировки в эмбриоидные тельца.
- Методы криорезекции для получения высококачественных образцов.
- Анализ клеточных и молекулярных характеристик ЭТ.
Основные результаты
- Успешное приготовление криосрезов из EB.
- Сохранение организации EB в криосрезах.
- Расширение возможностей изучения эмбриогенеза на клеточном уровне.
- Продемонстрированный метод может быть применен в различных исследовательских контекстах.
Выводы
- Данный метод позволяет проводить детальный анализ EB.
- Высококачественные криосрезы имеют большую ценность для исследований эмбрионов.
- Этот подход может способствовать углублению понимания дифференцировки стволовых клеток.
Часто задаваемые вопросы
Практическая значимость для отрасли
Высококачественное криосекционирование эмбриоидных телец (ЭТ), полученных из плюрипотентных стволовых клеток, позволяет проводить точный пространственный анализ маркеров дифференцировки и организации тканей, что способствует раннему поиску и валидации мишеней в регенеративной медицине и биологии развития. Данная возможность повышает прогностическую достоверность моделей на основе стволовых клеток и позволяет принимать обоснованные с учетом рисков решения в ключевых точках процесса разработки. Надежное криосекционирование ЭТ способствует кросс-функциональной интеграции данных для развития портфеля проектов.
Стратегические области применения в биофармацевтических исследованиях и разработках
Ранние этапы поиска и валидация мишени
- Позволяет исследовать экспрессию маркеров плюрипотентности и специфических маркеров клеточных линий в трехмерных структурах EB.
- Способствует снижению биологических рисков за счет уточнения путей дифференцировки и клеточной гетерогенности.
- Обеспечивает пространственный контекст для функциональной валидации мишеней в системах, производных от стволовых клеток.
Скрининг и разработка анализа
- Облегчает подготовку стандартизированных криосрезов эмбриональных тел (EB) для воспроизводимого проведения иммунофлуоресцентного анализа и гибридизации in situ.
- Позволяет проводить количественную оценку распределения белков и РНК в срезах EB.
- Обеспечивает масштабируемость анализа и повторное использование платформы для скрининга соединений в моделях стволовых клеток.
Трансляционные и доклинические исследования
- Сопоставляет дифференцировку in vitro с процессами развития in vivo для моделирования патологических состояний.
- Обеспечивает непрерывность процесса от этапа открытия до доклинической валидации за счет сохранения архитектуры EB и локализации маркеров.
- Предоставляет данные о механизмах, которые служат основой для разработки стратегий трансляционных биомаркеров.
Интеграция в конвейеры и рабочие процессы
Данный метод криосекционирования интегрируется в континуум исследований: от ранних этапов изучения дифференцировки стволовых клеток до разработки анализов и валидации доклинических моделей.
- Открытия в биологии: позволяет проверять гипотезы о плюрипотентности и определении клеточных линий в эмбриональных тельцах (ЭТ).
- Скрининг: обеспечивает воспроизводимые количественные показатели экспрессии маркеров и организации тканей.
- Аналитика: позволяет проводить измерения с пространственным разрешением для сравнительного анализа условий дифференцировки.
- Трансляционные исследования: связывает результаты, полученные in vitro, с данными о развитии in vivo при подтверждении паттернами экспрессии маркеров.
- Корпоративное повторное использование: устанавливает стандартизированный рабочий процесс анализа ЭТ, применимый к нескольким линиям стволовых клеток и протоколам дифференцировки.
Операционное и корпоративное воздействие
- Научная ценность: повышает достоверность прогнозирования дифференцировки стволовых клеток и валидации мишеней.
- Операционная ценность: стандартизирует секционирование EB для воспроизводимости последующих анализов.
- Стратегическая ценность: улучшает принятие решений о продолжении или прекращении исследований (go/no-go), предоставляя надежные пространственные и молекулярные данные.
- Влияние на портфель: позволяет осуществлять приоритизацию программ поиска лекарств на основе стволовых клеток с учетом рисков.
Особенности реализации
- Требуется опыт проведения криосекционирования и работы с хрупкими трехмерными клеточными агрегатами.
- Необходим доступ к криостатам, средам для заливки и инфраструктуре визуализации для последующего анализа.
- Требуется стандартизация протоколов подготовки и секционирования EB между исследовательскими группами.
- Метод применим к различным линиям плюрипотентных стволовых клеток и моделям дифференцировки при условии контроля размера и морфологии EB.
- Качество и интерпретируемость срезов зависят от тщательной ориентации и правильной заливки образцов.
