Сотовые Электромуфтовая Визуализированные с флуоресцентной микроскопии
1 июля 2010 г.
В этом видео мы продемонстрирована высокая эффективность электромуфтовой клеток В пробирке С помощью модифицированного метода с помощью соблюдения электропорации и последующего обнаружения плавленого визуализации клеток с флуоресцентной микроскопии.
Электрофузия заключается в воздействии коротких высоковольтных электрических импульсов на клетки, находящиеся в тесном контакте. В данном видео мы демонстрируем электрофузию клеток in vitro с помощью модифицированного метода адгезии (Adherence Method). Эксперименты проводились на клетках меланомы мыши линии BF1.
Для проведения эксперимента выполните следующие действия. Вырастите клетки в двух отдельных культуральных колбах до 80% конфлюэнтности. Отдельно добавьте по 2.1 µL каждого стокового раствора.
Добавьте 10 мМ C-M-F-D-A или CMRA соответственно в три миллилитра буфера Кребса-Хесса в центрифужной пробирке. Дважды промойте клетки буфером Кребса-Хесса, затем введите загрузочные растворы в колбы. Загрузочные растворы содержат примерно семь мкМ C-M-F-D-A или CMRA соответственно.
Инкубируйте клетки в течение 30 минут в контролируемой атмосфере. Во время этой первой инкубации реагенты свободно проникают через клеточные мембраны в цитозоль, где они превращаются в мембранно-проницаемые продукты реакции IMP. После первой инкубации промойте клетки, а затем инкубируйте их в культуральной среде еще в течение двух часов.
Клетки наблюдают с помощью флуоресцентного микроскопа, оснащенного охлаждаемой CCD-камерой, используя программное обеспечение для сбора данных. Установите длину волны возбуждения 548 нм и выберите соответствующий полосовой фильтр для получения изображения флуоресценции клеток, окрашенных CMRA. Для клеток, окрашенных CFDA, установите длину волны возбуждения 492 нм и выберите полосовой фильтр для получения изображения зеленой флуоресценции. Посчитайте количество клеток в обеих колбах, смешайте красные и зеленые клетки в соотношении один к одному и доведите концентрацию клеток до 5 миллионов клеток на мл.
Поместите каплю клеточной суспензии объемом 20 µL в центр каждой лунки. Инкубируйте клетки в 24-луночном планшете в контролируемой атмосфере в течение 20 минут, чтобы клетки слегка прикрепились к поверхности лунки в виде монослоя и установили межклеточные контакты. Поместите планшет с клетками на предметный столик микроскопа.
Разместите электроды на дне лунки и подключите их к генератору импульсов. Для достижения оптимального электрослияния и сохранения жизнеспособности клеток следует использовать подходящие параметры электрических импульсов. Эти параметры зависят от клеточной линии и должны быть определены в предварительных экспериментах. Удалите культуральную среду и промойте клетки одним миллилитром изотонического калий-фосфатного буфера, затем добавьте 350 микролитров гипотонического калий-фосфатного буфера для индуцирования набухания клеток.
Выдержите клетки в гиперосмолярном буфере в течение двух минут перед приложением электрических импульсов. Электрические импульсы следует подавать, когда клетки достигнут своего максимального объема, то есть до начала регуляторного изменения объема.
Снижение в нашем эксперименте. Применяли серию из восьми прямоугольных импульсов длительностью 100 микросекунд с частотой 1 герц. После подачи импульсов.
Оставьте клетки в покое на 10 минут. Определите выход диффузии с помощью фазово-контрастного и флуоресцентного микроскопов. Получите три изображения — фазово-контрастное, красную и зеленую флуоресценцию — в пяти случайно выбранных полях зрения.
Для каждого триплета изображений в программе ImageJ создаются трехканальные изображения с целью повышения их визуального качества; к исходным изображениям применяются этапы предварительной обработки: вычитание фона и повышение контрастности с использованием наборов параметров по умолчанию. В завершение, с помощью плагина RGB to Gray в ImageJ формируются итоговые трехканальные изображения. На таких изображениях можно одновременно наблюдать покоящуюся цитоплазму и клеточные мембраны.
Таким образом, в трехканальном изображении можно легко определить количество всех трех типов клеток: красных, зеленых и дважды флуоресцентных. Определите процент дважды флуоресцентных клеток, разделив их количество на общее число клеток в каждом изображении. Выход слияния затем определяется как процент дважды флуоресцентных клеток, умноженный на два.
Поскольку при просмотре клеток одного цвета половина видимых клеток не обнаруживается.
Обзор
В данном видео демонстрируется эффективная электрофузия клеток in vitro с использованием модифицированного метода адгезии в сочетании с электропорацией. Процесс включает детектирование гибридных клеток с помощью флуоресцентной микроскопии.
Основные компоненты исследования
Область науки
- Методы слияния клеток
- Методы электропорации
- Применение флуоресцентной микроскопии
Теоретические основы
- Электрофузия — это метод, при котором используются электрические импульсы для стимуляции слияния клеток.
- Данный метод позволяет повысить эффективность создания гибридных клеток.
- Флуоресцентная микроскопия позволяет визуализировать слившиеся клетки.
- Понимание механизмов слияния клеток имеет решающее значение для различных биологических приложений.
Цель исследования
- Продемонстрировать надежный метод электрослияния клеток.
- Визуализировать и количественно оценить эффективность слияния клеток.
- Предоставить протокол, который может быть воспроизведен в других лабораториях.
Используемые методы
- Клетки меланомы мыши культивировали и подготавливали к слиянию.
- Для маркировки клеток перед слиянием использовали флуоресцентные красители.
- Для индуцирования слияния клеток применяли электрические импульсы.
- Для анализа результатов слияния использовали флуоресцентную микроскопию.
Основные результаты
- Успешное слияние клеток было подтверждено с помощью флуоресценции.
- Для определения выхода слияния рассчитывали процент двухцветных флуоресцентных клеток.
- Были определены оптимальные параметры электрического импульса для сохранения жизнеспособности клеток.
- Визуальное качество изображений было улучшено с помощью методов обработки изображений.
Выводы
- Модифицированный метод адгезии эффективен для электрослияния клеток.
- Флуоресцентная микроскопия является ценным инструментом для оценки эффективности слияния.
- Данный протокол может быть адаптирован для различных типов клеток, используемых в исследованиях.
Часто задаваемые вопросы
Практическая значимость для промышленности
Электрофузия клеток, визуализированная с помощью флуоресцентной микроскопии, представляет собой невирусную и нехимическую платформу для создания гибридных клеток, что способствует исследованиям в области биофармацевтики на ранних этапах. Количественная визуализация актов слияния позволяет проводить надежную оценку методов манипулирования клетками, что напрямую влияет на валидацию мишеней и разработку анализов. Данный подход повышает прогностическую уверенность в рабочих процессах на основе клеточных моделей и служит основой для принятия решений по портфелю проектов с учетом рисков.
Стратегическое применение в биофармацевтических исследованиях и разработках
Первичный поиск и валидация мишени
- Позволяет напрямую исследовать механизмы слияния клеток, что важно для проверки терапевтических гипотез.
- Обеспечивает функциональную валидацию стратегий манипуляции клетками для создания гибридных клеток.
- Способствует снижению биологических рисков путем количественной оценки эффективности и специфичности слияния.
- Предоставляет измеряемые показатели для приоритизации портфеля проектов и подтверждения надежности мишеней.
Скрининг и разработка анализа
- Создание валидированных клеточных систем для последующего скрининга фенотипов, зависящих от слияния.
- Обеспечение стандартизированного и воспроизводимого количественного определения выхода слияния с помощью двойной флуоресценции.
- Возможность масштабирования анализа и повторного использования платформы для оценки соединений, нацеленных на процессы слияния клеток.
- Поддержка надежного сравнительного анализа протоколов слияния для различных типов клеток.
Трансляционные и доклинические исследования
- Соответствует трансляционным рабочим процессам, позволяя создавать гибридные клетки для доклинического моделирования.
- Обеспечивает непрерывность процесса от этапа открытия до доклинической валидации клеточных терапевтических методов.
- Снижает механистическую неопределенность в стратегиях манипулирования клетками при разработке терапевтических средств.
- Поддерживает продвижение концепций терапии на основе слияния клеток с учетом оценки рисков.
Интеграция конвейеров и рабочих процессов
Данный метод интегрируется в континуум от открытия до доклинических исследований, обеспечивая надежный количественный анализ и визуализацию слияния клеток, что способствует как ранней валидации, так и трансляционным исследованиям.
- Биология открытий: Количественное измерение выхода слияния поддерживает проверку гипотез и уточнение сигнальных путей.
- Скрининг: Двойной флуоресцентный отклик обеспечивает воспроизводимую разработку и бенчмаркинг анализов.
- Аналитика: Количественный анализ на основе изображений дает объективные и сопоставимые результаты для оценки условий.
- Трансляционные исследования: Создание гибридных клеток поддерживает доклиническое моделирование и согласование биомаркеров.
- Корпоративное повторное использование: Рабочий процесс adaptable к различным типам клеток и исследовательским программам, что повышает ценность платформы.
Операционное и корпоративное воздействие
- Научная ценность: Повышает прогностическую достоверность и снижает механистическую неопределенность в рабочих процессах слияния клеток.
- Операционная ценность: Стандартизирует количественную оценку слияния и обеспечивает воспроизводимость результатов между исследовательскими группами.
- Стратегическая ценность: Служит основой для принятия решений о продолжении или прекращении разработки (go/no-go) и повышает эффективность использования капитала в программах на ранних стадиях.
- Влияние на портфель: Позволяет проводить приоритезацию стратегий клеточной терапии с учетом рисков.
Особенности реализации
- Требуется опыт работы с культурами клеток, флуоресцентной микроскопией и анализом изображений.
- Необходим доступ к генераторам импульсов, флуоресцентным микроскопам и программному обеспечению для обработки изображений.
- Требуется межгрупповая стандартизация протоколов маркировки, визуализации и количественного анализа.
- Адаптация для различных клеточных линий может потребовать оптимизации параметров импульсов и условий маркировки.
- Эффективность слияния и жизнеспособность клеток зависят от конкретной клеточной линии и должны быть определены экспериментально.
