Корреляционный световой и электронной микроскопии (CLEM) как инструмент для визуализации микроинъекции молекул и их Эукариотические Sub-клеточных мишеней

Общая цель следующего эксперимента заключается во введении флуоресцентно меченных малых молекул или белков в цитоплазму культивируемой клетки млекопитающего и наблюдении за индуцированными морфологическими изменениями с разрешением от микрометра до нескольких нанометров. Для этого сначала клетки млекопитающего культивируют на покровных стеклах с сеточкой, после чего в них микроинъектируют интересующую флуоресцентно меченную малую молекулу или белок. Затем клетки фиксируют в формальдегиде, после чего проводят их наблюдение и получение изображений с помощью флуоресцентной микроскопии.

Затем клетки фиксируют глутаральдегидом, делают срезы, окрашивают и визуализируют с помощью электронной микроскопии. В завершение изображения, полученные при светлопольной флуоресцентной и электронной микроскопии, объединяют и совмещают. В конечном итоге корреляция этих изображений позволяет исследователю с высоким разрешением визуализировать изменения, вызванные интересующей малой молекулой или белком.

Здравствуйте, я доктор Эван Реддик из лаборатории доктора Нила Альто с кафедры микробиологии Техасского университета Southwestern Medical Center в Далласе. Сегодня я расскажу вам о процедуре M-CLEM, или корреляционной световой и электронной микроскопии с микроинъекцией. Основное преимущество этого метода по сравнению с отдельными техниками, такими как микроинъекция или микроскопия, заключается в том, что здесь они выполняются совместно с использованием покровного стекла с нанесенной сеткой.

Именно наличие сетки на покровном стекле позволяет исследователям возвращаться к одной и той же клетке на разных этапах протокола. Кроме того, данный метод дает возможность наблюдать индуцированные изменения субклеточной архитектуры под воздействием широкого спектра инжектируемых малых молекул или интересующих белков, причем с разрешением от микрометра до нескольких нанометров. Для подготовки к микроинъекции культивируйте клетки, такие как нормальные клетки почек крысы или иммортализованные клетки рака шейки матки, на фототравленых покровных стеклах с сеткой, закрепленных в чашках для живых клеток; инкубируйте клетки при 37 °C и 5% CO2.

В зависимости от планируемого графика эксперимента отрегулируйте степень конфлюэнтности клеток. Полная конфлюэнтность клеток на планшете значительно затруднит идентификацию микроинъецированных клеток при электронной микроскопии. Таким образом, посейте клетки таким образом, чтобы к дню проведения короткого эксперимента степень их конфлюэнтности составила около 50%, а для более длительных экспериментов — около 25%.

В день проведения длительного эксперимента подготовьте флуоресцентно меченные белки, ДНК или малые молекулы в соответствующем буфере до конечного объема 50 µL. В зависимости от выбранного флуорофора добавьте отслеживающий краситель, например Texas red или cascade blue. Добавьте вещества в концентрации от 0.5 до 1 mg/mL.

Профильтруйте раствор через центрифужный фильтр с порами 0,22 micron. После вытягивания игл для микроинъекций в соответствии с инструкциями производителя осторожно перенесите несколько микролитров раствора в заднюю часть иглы с помощью пипетки. Установите иглу в манипулятор коммерческого устройства для микроинъекций, закрепленного на инвертированном микроскопе.

Поместите чашку с культурой клеток в держатель для чашек инвертированного микроскопа. Найдите клетки, растущие внутри фототравленой сетки, и запишите буквенно-цифровой идентификатор этой сетки. Он будет использоваться на всех последующих этапах.

Важно выбирать для микроинъекций клетки, прикрепившиеся близко к центру покровного стекла, и избегать тех, что расположены у периферии. Это необходимо для обеспечения эффективного переноса интересующих вас клеток в центральную часть эпоксидной смолы, используемой далее при электронной микроскопии. Вручную опустите манипулятор для инъекций над покровным стеклом и с помощью микроманипулятора опустите иглу до тех пор, пока ее кончик осторожно не коснется поверхности клеток. Выполняйте микроинъекции в каждую вторую клетку в пределах выбранной сетки; при плотности посева клеток около 50% ожидается примерно 80 клеток на сетке площадью 600 square micrometer, что обеспечит выборку N около 30–40 экспериментальных и контрольных клеток.

После инъекции поместите чашку обратно в инкубатор на необходимое время перед проведением флуоресцентной микроскопии. Удалите питательную среду и зафиксируйте клетки формальдегидом в PBS при комнатной температуре в течение 10 минут. Замените фиксатор на один объем XPBS.

Затем задокументируйте расположение клеток, сделав от 5 до 10 изображений выбранной сетки в светлом поле при малом и большом увеличении. Для идентификации микроинъецированных клеток сделайте флуоресцентные снимки на длинах волн возбуждения и эмиссии инертного красителя, использованного при инъекции. С помощью конфокального микроскопа соберите Z-стек изображений микроинъецированных клеток при большом увеличении в пределах той же ранее исследованной сетки.

Для сопоставления флуоресцентных изображений с субклеточными структурами, которые будут идентифицированы с помощью электронной микроскопии, требуется большое увеличение. После конфокальной визуализации используйте раствор для удаления покровных стекол, чтобы отделить покровное стекло от чашки, и поместите его стороной с клетками вверх в новую культуральную чашку, содержащую XPBS. Переходите к подготовке образцов для электронной микроскопии.

Следуйте стандартным протоколам ЭМ. Для фиксации, окрашивания и обезвоживания образцов подготовьте эпон-смолу и поместите покровное стекло стороной с клетками вниз в пробирку, заполненную эпон-смолой. Оставьте смолу для полимеризации при 60 °C на 24 часа.

Чтобы отделить покровное стекло от эпоксидной смолы Epon, быстро погрузите его в жидкий азот. Температурный шок при переходе от 60 °C к -196 °C.

Отделите покровное стекло от смоляной трубки. Подождите от 5 до 10 минут, затем извлеките трубку, из которой теперь удалено покровное стекло. Под стереомикроскопом осмотрите поверхность смолы, чтобы найти интересующую вас сетку.

С помощью стерильного лезвия бритвы или скальпеля обрежьте блок из Epon так, чтобы в верхней части блока осталась только интересующая вас сетка. С помощью ультрамикротома из обрезанного блока сделайте серию последовательных срезов; для контрастирования срезов используйте стандартные протоколы с применением уранилацетата и цитрата свинца. Найдите нужные клетки в электронном микроскопе, используя в качестве ориентира их относительное расположение, опираясь на полученные ранее флуоресцентные изображения высокого разрешения.

Определите на электронном микрофотографическом снимке области интереса, которые соответствуют флуоресцентному сигналу. Используйте такие ориентиры, как расположение гетерохроматина и ядерной оболочки, чтобы определить, какое флуоресцентное изображение Zack соответствует срезу ПЭМ. Откройте снимки в программе для визуализации, такой как Image J или Adobe Photoshop, уменьшите непрозрачность флуоресцентного изображения до 50% и наложите его на соответствующее ПЭМ-изображение.

Сопоставьте изображения, отрегулировав отображаемый масштаб. Ниже представлены результаты микроинъекции и корреляционной световой и электронной микроскопии. На этом изображении показана микрофотография клеток NRK, растущих на стеклянном покровном стекле с лазерной сеточной разметкой, полученная в светлом поле.

Обратите внимание на буквы b и m на фоне, которые используются для идентификации сетки с инъецированными клетками. Стрелками указаны две клетки, которые были идентифицированы и визуализированы с помощью электронной микроскопии. Здесь представлено флуоресцентное изображение инертного трекирующего красителя cascade blue, используемого для идентификации микроинъецированных клеток.

Здесь представлено совмещение сигналов в светлом поле и флуоресценции малой молекулы, меченной амином. На этой панели показана корреляция между микроскопией в светлом поле, флуоресцентной и электронной микроскопией инъецированной клетки. Наконечник стрелки указывает на флуоресцентные пункты, изображение которых при большем увеличении приведено на данной панели.

После просмотра этого видео вы должны будете хорошо понимать, как проводить микроинъекцию интересующего белка и отслеживать вызываемые им субклеточные морфологические изменения с помощью метода микроинъекционной CLEM (корреляционной световой и электронной микроскопии).