Узорные Фотостимуляция с цифровыми устройствами Micromirror по расследованию Дендритные интеграции между точками ветвления

Общая цель данной процедуры заключается в управлении сложными пространственно-временными паттернами света для последующей стимуляции нейронов. Это достигается путем первоначального размещения чипа DMD в соответствующей сопряженной плоскости изображения на оптическом пути микроскопа. Вторым этапом процедуры является надлежащее освещение DMD интенсивным источником света, например лазером.

Третьим этапом процедуры является устранение эффекта спекл-шума, возникающего при когерентном освещении. Заключительным этапом является интеграция графического пользовательского интерфейса для управления чипом DMD. В конечном итоге полученные результаты демонстрируют, что эксперименты, которые ранее было трудно реализовать, теперь могут быть относительно легко выполнены с помощью многоточечного лизиса «заклеточных» нейромедиаторов с использованием системы DMD.

Здравствуйте, меня зовут Майкл Мохаммед, я сотрудник лаборатории доктора Чаман Танг на кафедре неврологии Университета Мэриленда. Сегодня мы продемонстрируем процедуру создания сложных паттернов стимуляции с помощью оптического микроскопа. В нашей лаборатории мы используем этот метод для изучения дендритной интеграции.

Итак, приступим. В данном протоколе будет продемонстрирован принцип работы системы освещения на базе цифрового микрозеркального устройства (DMD) для экспериментальной нейробиологии. DMD представляет собой оптический полупроводниковый чип с несколькими сотнями тысяч микроскопических подвижных зеркал, расположенных в виде прямоугольного массива; положение каждого зеркала на его поверхности соответствует пикселю изображения.

Каждым зеркалом можно управлять индивидуально, наклоняя его между двумя положениями. В выключенном положении свет направляется в сторону от оптической оси освещения образца. Во включенном положении свет направляется вдоль оптической оси.

DMD хорошо подходит для лизиса, поскольку выдерживает воздействие очень интенсивного УФ-излучения, обеспечивает высокий коэффициент контрастности между включенными и выключенными пикселями и может переключаться между этими двумя состояниями за десятки микросекунд. Применению DMD в биомедицинских исследованиях способствует широкое использование программного и аппаратного обеспечения для обработки изображений, а также коммерческий интерес к области отображения изображений. Модульные компоненты выводятся на рынок компанией Texas Instruments в виде комплектов DLP discovery, которые включают вспомогательные электронные драйверы для адаптации DMD к микроскопической системе.

Необходимо понимать основные концепции оптики микроскопии. Современный базовый флуоресцентный микроскоп состоит из тракта формирования изображения и тракта освещения. В его состав входят объектив, фильтр-куб и две отдельные тубусные линзы для трактов изображения и освещения.

Микроскоп сконструирован таким образом, чтобы иметь плоскости, сопряженные с плоскостью изображения препарата; объекты, находящиеся в фокусе в плоскости препарата, будут также находиться в фокусе в этих сопряженных плоскостях изображения. Из этого концепта следует, что любое яркое изображение, созданное в сопряженной плоскости, будет четко проецироваться на плоскость изображения препарата. Данная стратегия используется для проецирования сгенерированного компьютером паттерна освещения на препарат.

Лазерный луч служит очень ярким источником света, который освещает паттерн, формируемый микрозеркалами на чипах DMD, расположенных в сопряженной плоскости изображения. Конструкция системы освещения DMD зависит от источников возбуждения, используемых в оптогенетических экспериментах, в которых применяется свет видимого диапазона длин волн. Освещенный паттерн может быть передан через тракт камеры.

Таким образом, чип DMD можно просто установить в один из двух портов для камер модуля с двумя портами. Напротив, для экспериментов с использованием света в УФ-диапазоне, таких как лизис «заклеточных» соединений (caged compounds), свет должен подаваться через путь эпи-освещения, при этом необходимо создать более доступную плоскость сопряженного изображения. Это связано с тем, что тубусная линза объектива не предназначена для пропускания УФ-излучения.

Вместо этого для пропускания УФ-излучения используется тубусная линза осветителя, которая обеспечивает надлежащее формирование изображения. Каждое микрозеркало на DMD может переключаться между положительным и отрицательным наклоном в 12 градусов относительно плоскости чипа. В зависимости от цифрового сигнала, поступающего с компьютера, ось вращения проходит вдоль диагональных углов каждого зеркала под углом 45 градусов к прямоугольным сторонам чипа.

Направление наклона зеркала обозначено золотистым треугольником в одном из углов на передней поверхности чипа. Наклон микрозеркала определяет согласование угла наклона и азимута входящего пучка освещения. Для освещения DMD сначала установите угол наклона пучка освещения на 24 градуса относительно перпендикулярной оси чипа DMD, а азимут настройте перпендикулярно оси вращения зеркала.

Точное выравнивание луча имеет решающее значение для эффективной работы. Для экспериментов по лизису используйте лазерный источник для создания высокоинтенсивного фокусируемого луча, необходимого для быстрого высвобождения (анкейджинга).

Здесь используется квазинепрерывный твердотельный лазер с диодной накачкой и утроением частоты на Nd:YAG; применяется лазер с относительно высокой мощностью, так как на образец фактически поступает лишь небольшая часть выходного излучения. При использовании системы DMD выход лазера вводят в многомодовое волокно, чтобы его можно было легко позиционировать и ориентировать вдоль нужной оси для освещения DMD; это позволяет решить проблему спекл-шума, возникающего при когерентном освещении, путем пропускания света через оптическое волокно.

Волокно наматывают на пьезоэлектрический растяжитель волокна, который приводит его в колебание с частотой около 40 килогерц. Микроскопическое растяжение волокна достаточно для многократного смещения спекл-структуры в течение миллисекундной длительности каждого импульса фотостимуляции, что эффективно устраняет эффект спекл-интерференции. Наконец, выход оптического волокна коллимируют с помощью УФ-объектива микроскопа для освещения DMD; для корегистрации пикселей ПЗС-матрицы с программным обеспечением DMD было написано ПО, которое соотносит отдельные зеркала DMD с конкретными пикселями ПЗС-камеры визуализации.

Графический пользовательский интерфейс программного обеспечения позволяет пользователю с помощью компьютерной мыши назначать ориентацию зеркала DMD, соответствующую определенной области на изображении с ПЗС-матрицы. Пометьте место для фотостимуляции, переместив курсор по изображению на экране компьютера, и щелкните по отмеченной области интереса, чтобы запрограммировать хранилище паттернов подачи света. Паттерн, отмеченный на экране компьютера в виде серии отдельных изображений, программирует в программном обеспечении время лазерных импульсов для каждого пространственного паттерна.

Это будет интегрировано с программой сбора данных P clamp. В завершение используйте программу сбора данных для координации синхронизации электроники DMD, стробирования лазера и регистрации электрического сигнала с целевого нейрона, зафиксированного методом патч-клампа. Здесь показана калибровка разрешения оптической системы.

Минимальный размер пятна показан на основе измерений с использованием флуоресцентной мишени. Эффективное физиологическое разрешение измеряется по амплитуде тока в зависимости от фотостимуляции. Положение пятна: здесь заблокированный глутамат подвергался фотолизу рядом с дендритной ветвью диаметром 2 мкм.

При перемещении пятна ортогонально по всей длине показаны электрические ответы на фотостимуляцию различной интенсивности. Представлены ответы при фиксированном напряжении в зависимости от интенсивности лизиса.

Дистрибутивную дендритную стимуляцию можно легко реализовать с помощью системы на основе DMD. В данном случае интенсивность входного сигнала варьировали путем увеличения количества точек фотостимуляции, отмеченных кружками на двух дендритных ветвях. Пространственная суммация может быть нелинейной при прохождении через точки ветвления.

С увеличением амплитуд входных сигналов, поступающих на две ветви за «дверью», зависимость становится все более суперлинейной. Эти результаты наглядно иллюстрируют нелинейный характер суммирования в точках ветвления дендритов. Суперлинейность в значительной степени опосредована NMDA-рецепторами, а не потенциал-зависимыми каналами.

Это может быть продемонстрировано при применении двух антагонистов NMDA: APV и MK 801 в значительной степени устраняют нелинейное поведение. Мы только что представили вам базовую конструкцию и принцип работы системы на основе DMD для паттернированной фотостимуляции нервной ткани. Система может быть адаптирована для стимуляции видимым светом, который, например, используется в оптогенетических экспериментах.

Эта установка также может быть адаптирована для ближнего УФ-излучения, которое используется для однофотонного лизиса. При выполнении этой процедуры важно помнить, что если используется свет с длиной волны менее 400 nanometers и большинство пользователей направляют его через путь эпи-освещения, критически важным становится точное совмещение освещающего луча с точностью до нескольких градусов, а при использовании когерентного света необходимо эффективно устранить эффект спеклинга. На этом все.

Благодарим за просмотр и желаем успехов в ваших экспериментах.