Экспериментальные модели для изучения пигментного эпителия сетчатки физиологии и патофизиологии

Общая цель данной процедуры заключается в получении культур эпителия сетчатки глаза человека (RPE), которые могут быть использованы в качестве модели. При исследовании заболеваний глаз человека ткани поступают от доноров в виде целых глазных яблок. Первым этапом процедуры является удаление излишков мышечной и соединительной ткани с последующим вскрытием глаза путем удаления роговицы и хрусталика.

Глаз обрабатывают диспазой и распластывают, после чего монослой РПЭ отделяют от хориоидеи путем диссекции. Клетки РПЭ высевают в флаконы и культивируют в течение нескольких недель до достижения состояния конфлюэнтного монослоя и развития пигментации. Клеточные культуры используют для функциональных экспериментов in vitro.

Успешные эксперименты in vitro повторяются на моделях животных в рамках доклинических испытаний, где ответы RPE можно лучше оценить в более сложных условиях передачи сигналов. Описанная здесь модель позволит лучше понять физиологию RPE и разработать новые терапевтические методы лечения глазных заболеваний. Здравствуйте, меня зовут Шелдон Миллер.

Моя лаборатория находится в Национальном институте глаз, который является частью Национальных институтов здравоохранения в кампусе Бетесда, штат Мэриленд. Здравствуйте, я Арки из лаборатории Миллера. Сегодня мы продемонстрируем процедуру подготовки первичных культур эпителиальных клеток ретинального пигмента плода человека.

Данные клетки будут подготовлены в виде сливающихся монослоев, которые можно разместить в модифицированных камерах. Мы также будем использовать эти изолированные клетки РПЭ человека для биохимических и генетических исследований. В нашей лаборатории мы применяем данную процедуру для создания первичных культур эпителиальных клеток с целью изучения функций и регуляции физиологических и патофизиологических процессов, а также для разработки клинических моделей заболеваний на животных.

Мы фокусируемся на ретинальном пигментном эпителии (РПЭ), который расположен в задней части глаза, отделяя нейросенсорную сетчатку от кровоснабжения хориоидеи. На этой схематической диаграмме глаза показано расположение слоя РПЭ в задней части глаза, непосредственно прилегающего к фоторецепторам. На врезке показаны клетки сетчатки: фоторецепторы справа и ганглионарные клетки слева.

Этот эпителий чрезвычайно активен с точки зрения метаболизма. Он непрерывно, в течение суток, осуществляет фагоцитоз фоторецепторов, а также накапливает, перерабатывает и транспортирует зрительный пигмент витамин A к фоторецепторам. В зрительном цикле он выполняет гомеостатическую функцию, поддерживая химический состав и объем окружающих внеклеточных пространств.

Критическим свойством эпителия является его полярность. Постоянная асимметричная доставка белков к апикальной и базально-латеральной мембранам представляет собой регулируемый процесс, который позволяет эпителию осуществлять векторный транспорт метаболитов, ионов и жидкости из одного внеклеточного пространства в другое. Эта активность помогает эпителию поддерживать здоровье и целостность нейросенсорной сетчатки.

Описанный здесь метод подготовки in vitro позволяет анализировать транспортные белки, рецепторы и сигнальные пути, определяющие полярность и функцию эпителия, еще до начала диссекции. В ламинарном шкафу подготовьте 12-луночный планшет с растворами комнатной температуры. Для каждого глаза потребуется одна лунка с 10-кратным раствором антибиотика-антимикотика, две лунки с 1X XPBS и одна лунка с раствором 2 units/mL диска пространства, разведенным в 5% среде RPE с сывороткой. Наполните диссекционную чашу с силиконовой подложкой раствором 1X-H-B-S-S, слейте жидкость и перенесите каждый глаз в отдельную лунку с раствором антибиотика-антимикотика.

Инкубируйте от трех до пяти минут при комнатной температуре. Избегайте избыточного давления на глазное яблоко. Промойте глаз в двух последовательных лунках с XPBS, чтобы удалить излишки антибиотика.

Затем с помощью пинцета перенесите его в препаровальную чашку, наполненную X-H-B-S-S, под диссекционным стереомикроскопом. Используйте ирисные ножницы, чтобы удалить избыток мышечной и соединительной ткани вокруг глаза. Расположите глаз так, чтобы роговица была обращена вверх.

Используйте две стерильные иглы 27G, чтобы зафиксировать глаз за соединительную ткань к силиконовому коврику, не повреждая склеру. В таком положении с помощью ножа для бокового порта сделайте разрез склеры. Разрез должен находиться на расстоянии одной трети пути от экватора глаза до передней поверхности.

С помощью ирисных ножниц продолжите круговой разрез вокруг глаза, чтобы избежать повреждения ретинального пигментного эпителия (RPE) из-за притяжения стекловидного тела к сетчатке. Теми же ножницами разрежьте стекловидное тело, чтобы отделить передний лоскут глаза от глазной чаши.

Приподнимите переднюю часть IOA и удалите ее. С помощью пинцета перенесите открытый глаз в лунку с dys. Убедитесь, что в глазу нет пузырьков воздуха.Cup.

Инкубируйте в течение 40–60 минут при 37 °C в атмосфере 5% CO2. Перенесите глаз из диска обратно в диссекционную чашку, наполненную свежим 1X HBSS комнатной температуры. Расположите глаз чашечкой вверх и зафиксируйте его двумя иглами калибра 27G.

Под диссекционным микроскопом с помощью тонкого пинцета осторожно приподнимите частично отделенную сетчатку и с помощью ретинальных ножниц отсеките ее от зрительного нерва. Удалите сетчатку, используя ножницы для радужки.

Сделайте разрез от периферии глаза к зрительному нерву. Закрепите глаз с помощью пяти игл калибра 27G. Чтобы растянуть слой РПЭ, используйте ретинальные ножницы для выполнения кругового разреза вокруг зрительного нерва.

Отделение слоя РПЭ при переключении на увеличение 250x или более. Найдите край листа РПЭ вдоль разреза, сделанного иридоточными ножницами, рядом с зрительным нервом. Используйте два пинцета, чтобы отделить РПЭ и мембрану Бруха от слоя хориоидальной ткани.

Проверьте несколько участков вдоль среза, чтобы определить место с наиболее слабой связью между РПЭ и хориоидеей. Осторожно отслоите мембрану, чтобы полностью ее удалить. Поместите листы РПЭ в коническую пробирку объемом 15 milliliter, заполненную раствором трипсина в EDTA комнатной температуры.

После сбора всех слоев закройте пробирку крышкой и инкубируйте пробирки на водяной бане в течение 10 минут при 37 °C. Интенсивно встряхните пробирку, чтобы разделить RPE на небольшие кластеры. Отсутствие темных скоплений клеток свидетельствует о завершении процесса разделения.

Верните пробирку в водяную баню еще на пять минут. С помощью пастера, пипетки и осторожного всасывания удалите все остатки непереваренной ткани. Центрифугируйте клетки при 280 5G в течение четырех минут.

Удалите супернатант. Доведите конечный объем до девяти миллилитров с помощью среды 15%RPE, используя пипетку, для ресуспендирования. Перенесите пипеткой три миллилитра клеточной суспензии в флакон объемом 25 квадратных сантиметров.

Добавьте два миллилитра свежей среды для культуры 15%RPE комнатной температуры. Инкубируйте клетки в течение ночи при 37 °C и 5% CO2. По мере созревания культур их пигментация будет увеличиваться через три-четыре недели.

Успешные культуры будут конфлюэнтными, с однородной и интенсивной пигментацией. Мы только что продемонстрировали вам способ приготовления первичных культур сетчатки человеческого плода. На этом все.

Спасибо за просмотр и удачи в ваших экспериментах.