Дифференциация, техническое обслуживание и анализ клеток человека сетчатки пигментного эпителия: модель болезни в блюдо для BEST1 перегласовок

Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы в области заболеваний сетчатки, связанных с ионными каналами, о молекулярных механизмах мутаций BEST1 и патологии бестрофинопатий. Основное преимущество этой методики заключается в том, что она позволяет избежать трудностей прямого получения клеток RPE от человека. Применение этого метода распространяется на терапию бестрофинопатий, включая болезнь Беста, поскольку клетки RPE могут быть использованы как в исследовательских целях, так и в клеточной заместительной терапии.

Когда культура hPSC достигнет сливаемости, замените питательную среду четырьмя миллилитрами дифференцировочной среды на лунку шестилуночного планшета. После двух недель культивирования дополните среду для дифференцировки 100 нанограммами на миллилитр человеческого активина-А, меняя добавляемую среду три раза в неделю в течение еще 14 дней. На 29-й день переключитесь на недобавленную среду для дифференцировки еще на 8-10 недель, пока не появятся кластеры пигментированных клеток РПЭ.

Чтобы изолировать пигментированные клетки РПЭ, сначала держите отдельные девятидюймовые стеклянные пипетки Пастера горизонтально над пламенем горелки Бунзена, примерно на две трети вниз по длине тонкой части пипетки. Когда нагретое стекло станет мягким, быстро раздвиньте два конца, чтобы на новом конце пипетки образовался наконечник, похожий на микроскребок. Распылите на вынутые пипетки 70% этанола и дайте им высохнуть на воздухе в колпаке для клеточных культур.

Когда пипетки будут готовы, промойте каждую лунку культуры для дифференцировки PBS и добавьте в каждую лунку по одному миллилитру 0,05% трипсина, дополненного одной единицей на микролитр коллагеназы. Через 20-30 минут при температуре 37 градусов Цельсия остановите сбраживание двумя миллилитрами среды RPE с температурой 37 градусов Цельсия на лунку шестилуночного планшета и поместите планшет на предметный столик для микроскопа. С помощью вытянутой пипетки аккуратно постучите по пигментированным кластерам РПЭ.

Как только клетки отделятся от дна лунки, с помощью 20-микролитровой микропипетки перенесите диссоциированные клетки в отдельные лунки новой клеточной культуральной пластины, содержащей среду РПЭ. После того, как приблизительно 5000 клеток RPE были добавлены в каждую лунку 12-луночного планшета, доведите окончательный объем до двух миллилитров с помощью свежей среды RPE и культивируйте изолированные клетки hPSC-RPE в течение еще шести-восьми недель, пока не будет наблюдаться монослой пигментированных и булыжниковидных зрелых клеток RPE. За 24-72 часа до наложения пластыря промойте пигментированные монослойные клетки двумя миллилитрами PBS, затем, после удаления PBS, добавьте один миллилитр 0,05% трипсина плюс одну единицу на микролитр коллагеназы в клетки в каждой лунке 12-луночного планшета в течение восьмиминутного инкубационного периода при 37 градусах Цельсия.

Когда клетки начнут отделяться, используйте микропипетку объемом в один миллилитр, чтобы аккуратно промыть клетки со дна лунки и собрать клеточную суспензию в 15-миллилитровую коническую трубку. Добавьте в лунку один миллилитр раствора трипсин-коллагеназы температурой 37 градусов Цельсия. Инкубируйте еще восемь минут при температуре 37 градусов по Цельсию, затем промойте все оставшиеся клетки со дна лунки и соедините клеточную суспензию в той же 15-миллилитровой конической трубке.

Инкубируйте клетки в сухой ванне при температуре 37 градусов Цельсия в течение восьми минут, затем с помощью микропипетки объемом в один миллилитр аккуратно растирайте клетки от 10 до 15 раз. После инкубации и растирания клеток еще два раза добавьте пять миллилитров среды RPE с температурой 37 градусов Цельсия в суспензию одиночных клеток и гранулируйте клетки центрифугированием. Повторно суспендируйте гранулу в объеме, необходимом для посева, на предварительно покрытые пластины с покровными стеклами при 10-20% слиянии и выполните заплатку целых ячеек в соответствии со стандартными протоколами.

После успешной изоляции более 90% клеток в популяции с нулевым пассажем должны созреть, чтобы проявить характерную морфологию клеток RPE. С помощью подхода, основанного на hPSC-RPE, каждая мутация BEST1, специфичная для пациента, может быть всесторонне охарактеризована с точки зрения экспрессии белка, мембранного транспорта и функции ионного канала, чтобы получить критически важную информацию для выяснения патологических механизмов RPE. Следует отметить, что некоторые мутации BEST1 могут влиять на экспрессию белка, поэтому следует также проверить другие хорошо установленные маркеры RPE.

Дифференцировка плюрипотентных стволовых клеток человека RPE занимает от трех до шести месяцев, в зависимости от линии плюрипотентных стволовых клеток человека и типа мутации, а выделение дифференцированных плюрипотентных клеток человека может быть завершено за два часа, если оно выполнено правильно. При попытке разделить клетки для зажима пластыря важно помнить, что растирать клетки нужно очень осторожно, чтобы избежать избыточной гибели клеток. После этой процедуры можно использовать другие методы, такие как 3D культивирование клеток RPE, чтобы ответить на дополнительные вопросы о том, как мутации BEST1 влияют на транспорт ионов на апикальных и базальных мембранах клеток RPE.

После своего развития этот метод проложил путь исследователям в области дегенеративных заболеваний сетчатки к изучению физиологических фенотипов и патологических механизмов клеток RPE, полученных от пациентов. После просмотра этого видео у вас должно сложиться хорошее представление о том, как дифференцировать плюрипотентные стволовые клетки в клетки пигментного эпителия сетчатки и подготовить клетки RPE к зажиму целых клеток.