Запись Многоклеточные Поведение в Myxococcus Ксанф Биопленки использованием Покадровый микрокиносъемки

Общая цель следующего эксперимента заключается в разработке недорогого метода микрокинематографии с интервальной съемкой, обладающего достаточной точностью для получения воспроизводимых и количественно оцениваемых результатов. Это достигается путем использования недорогих многоразовых силиконовых прокладок для создания агаровых планшетов или микропрепаратов на предметных стеклах. Полученные результаты показывают, что такие планшетные комплексы остаются гидратированными и достаточно оксигенированными в течение более чем одной недели при использовании различных типов сред и концентраций агара.

Кроме того, поскольку микрокиносъемка с интервалом во времени — это медленный процесс, использование восьми недорогих микроскопов помогает ускорить сбор данных. Здравствуйте, меня зовут Райан Тейлор, я представляю лабораторию доктора Роя Уэлча с кафедры биологии Сиракузского университета. Сегодня мы продемонстрируем процедуру создания таймлапс-видео бактериальных биопленок; в нашей лаборатории мы используем этот метод для изучения многоклеточного поведения биопленок MTIs.

Итак, приступим. Для начала данной процедуры измерьте плотность клеток ночной культуры Occus sanus с помощью колориметра. Перенесите 1 мл культуры в центрифужную пробирку объемом 2,5 мл, осадите, промойте и ресуспендируйте бактерии в среде TPM, как описано в прилагаемом письменном протоколе. Используйте дозатор и вортекс для полного ресуспендирования осадка; этот процесс может занять некоторое время. Затем добавьте 0,5 г ароза к 50 мл TPM, которая является рабочей средой для анализа.

Также добавьте 0,5 grams aros к 50 milliliters C-T-T-Y-E, которая представляет собой питательную среду для дисков, и стерилизуйте в автоклаве. Затем выдерживайте среду при 55 °C в инкубаторе или на водяной бане во время подготовки к проведению анализа трекинга.

Для создания питательного диска сначала простерилизуйте стекло предметного микроскопа в пламени горелки. Положите на предметное стекло стерильную силиконовую резиновую прокладку толщиной 0.5 millimeter. Пипеткой внесите около 300 microliters среды C TT YE в лунку, образовавшуюся между прокладкой и предметным стеклом.

Среду C-T-T-Y-E необходимо пламенем стерилизовать на другом предметном стекле, которое затем следует установить под углом поверх среды C-T-T-Y-E. Установка стекла под углом предотвращает образование пузырьков. После установки стекла зафиксируйте комплекс с помощью мини-зажимов, установив по одному с каждой стороны.

Поместите обрезанный комплекс при температуре 4 °C и дайте среде C-T-T-Y-E agro затвердеть. Обычно это занимает около пяти минут. После затвердевания среды можно подготовить комплексы на планшетах, используемые в анализе отслеживания.

Начните с подготовки предметных стекол для создания аналитических комплексов. Для каждого комплекса простерилизуйте два стеклянных предметных стекла в пламени горелки. Поместите прокладку от автоклава на одно из стекол, чтобы сформировать дно аналитической камеры.

Другой предметное стекло используется для выравнивания агароза и в качестве поддерживающего стекла. Верхним слоем анализа является покровное стекло. Сначала оберните предметное стекло маркировочной лентой, затем простерилизуйте покровное стекло в пламени и поместите его поверх обернутого стерилизованного стекла.

Сдвиньте вверх обертки-подставки для предметного стекла, чтобы приподнять покровное стекло и предотвратить его растрескивание. С помощью пинцета поместите прокладку для автоклава на стерилизованное пламенем покровное стекло. Надавите на прокладки на нижнем предметном стекле и покровном стекле, чтобы обеспечить их плотное прилегание к стеклу.

В противном случае среды в массивах могут высохнуть. Отложите в сторону узлы прокладки предметного стекла и прокладки покровного стекла стерильными сторонами вверх; с этого момента работайте только с одним комплексом за раз, чтобы предотвратить затвердевание массивов среды, что привело бы к низкому качеству видеозаписи. Начните с размещения питательного диска.

Достаньте комплекс питательных дисков из холодильника с температурой 4 °C. Снимите фиксирующую заслонку и аккуратно приоткройте предметные стекла, обнажая застывший агар C-T-T-Y-E, используя микропипетку с одноразовым стеклянным наконечником объемом 100 µL. Извлеките питательный диск диаметром 1 мм из среды агар C-T-T-Y-E и поместите его в лунку, образованную прокладкой на покровном стекле.

Затем извлеките из инкубатора кольца с TPM-средой и пипетируйте 300 µL в лунку, образованную прокладкой на покровном стекле и содержащую питательный диск. TPM-среда в кольце должна подняться куполом, чтобы разгладить поверхность среды T-P-M-S-A. Под углом накройте кольцо с TPM-средой одним из стерилизованных в пламени предметных стекол без прокладки. Размещение стекла под углом помогает предотвратить образование пузырьков воздуха.

Зафиксируйте комплекс с помощью мини-зажимов, установив по одному с каждой стороны. Поместите зафиксированный комплекс при температуре 4 °C и дайте агарозе застыть. Обычно это занимает около пяти минут.

После застывания среды извлеките комплекс из температуры 4 °C. Снимите зажимы и сожмите конец комплекса. Чтобы освободить обмотанный лентой предметное стекло, снимите его и положите на лабораторный стол для дальнейшего использования.

Затем, используя пинцет в качестве клина, отделите комплекс «покровное стекло — прокладка — массив сред» от предметного стекла-подложки и утилизируйте предметное стекло-подложку. Не используйте рычажное движение при отделении комплекса «покровное стекло — прокладка», так как это может привести к повреждению покровного стекла и/или прилипанию массива сред к предметному стеклу-подложке.

После снятия поддерживающего предметного стекла поместите комплекс из прокладки покровного стекла и массива среды на предметное стекло, обернутое лентой, прокладкой вверх. Расположите этот комплекс рядом с горелкой, чтобы вся видимая влага испарилась с вновь открытой поверхности среды agros. Не допускайте высыхания среды agros более одной минуты.

Поскольку это может повлиять на роевое поведение M Zant, перенесите клетки на свежеприготовленный диагностический комплекс. После испарения избыточной влаги из среды комплекса agros в области прокладки покровного стекла аспирируйте 0,5 µL концентрированной суспензии клеток для нанесения на среду. Плавно опустите наконечник пипетки перед подведением к среде agros.

На кончике наконечника пипетки появляется капля клеток, что облегчает их перенос без соприкосновения наконечника с агаровым средостением. Углубление на поверхности агара может изменить поведение роя mz. Переместите пипетку строго вниз, чтобы высадить клетки примерно в одном миллиметре от встроенного питательного диска.

Затем вытяните пипетку строго вертикально вверх. Таким образом обеспечивается круглая форма капли. После нанесения клеток поместите комплекс рядом с горелкой, чтобы оставить пятно с клетками подсохнуть не более чем на 20 секунд.

После высушивания совместите узел прокладки предметного стекла, образующий нижнюю часть комплекса, с прокладкой на крышке. Вставьте среду прокладки в ячейку комплекса, образующую верхнюю часть комплекса. Осторожно прижмите их друг к другу для создания герметичного уплотнения.

Протрите поверхности предметного и покровного стекол салфеткой Kimwipe, чтобы удалить любые загрязнения и предотвратить образование конденсата. Сразу после очистки поместите препарат на подогреваемый предметный столик микроскопа предметным стеклом вниз, а покровным стеклом вверх. Если образовался конденсат, оставьте препарат на подогреваемом столике на несколько секунд перед запуском программного обеспечения для сбора изображений.

Для подготовки к записи видео выберите подходящий объектив микроскопа: 2x, 4x или 10x. Включите камеру и микроскоп, проверьте уровень освещенности, чтобы убедиться, что свет не слишком интенсивный. Запустите компьютер и откройте программу для захвата изображений.

Нажмите на окно изображения в реальном времени и настройте фокусировку микроскопа. Изображение должно быть похоже на представленное здесь. Начните захват изображений.

Регулярно проверяйте фокусировку в течение первого часа, так как агаризованная среда имеет тенденцию к оседанию, что приводит к смещению фокуса. После завершения получения изображений перенесите их в хранилище. Разоберите комплекс предметных стекол, выдержав их в 90% ethanol в течение ночи, или обработайте прокладки TOLA для их повторного использования.

На этом таймлапс-видео показан процесс отслеживания, описанный в данной работе. Скорость съемки составляет один кадр в минуту при 20-кратном увеличении; скорость воспроизведения — 60 кадров в секунду. На данном таймлапс-видео представлена популяция клеток, в которой 1% клеток экспрессируют GFP.

Видео было составлено путем объединения попеременно сменяющих друг друга фазово-контрастных и флуоресцентных изображений. Анализ проводился на C-T-T-Y-E в 1%Aros; частота захвата составляла одно изображение в минуту при увеличении 100 x. На данной записи таймлапс-видео показана скользящая мотильность M Anthes.

Данный анализ проводили на C-T-T-Y-E в 1%Aros; частота захвата изображений составляла один кадр в минуту при увеличении 100 x. На этом TimeLapse-видео показана сократительная подвижность (twitching motility) P OSA. Данный анализ проводили на LB в 1%Aros; частота захвата изображений составляла один кадр в минуту.

При 20-кратном увеличении скорость воспроизведения составляет 60 кадров в секунду. На этом ускоренном видео показана роевая подвижность Smar. Данный анализ проводился на LB и 1%Aris; частота захвата кадров составляет один кадр в минуту.

При 20-кратном увеличении скорость воспроизведения составляет 60 кадров в секунду. На этом таймлапс-видео показана скользящая подвижность EGT. Данный анализ проводился на среде LB с 0,5% агарозой; скорость захвата составляет один кадр в минуту, а скорость воспроизведения при 20-кратном увеличении — 120 кадров в секунду из-за хрупкости 0,5% агарозы в LB.

В данном анализе используются более крупные прокладки, показанные на рисунке 1B. Мы только что продемонстрировали вам способ создания таймлапс-видео бактериальных биопленок. При выполнении этой процедуры важно помнить о необходимости действовать неспешно и максимально точно для достижения воспроизводимых результатов.

На этом всё. Спасибо за просмотр и удачи в ваших экспериментах.