Количественный анализ случайных миграции клеток помощью замедленной видео микроскопии

Общая цель следующего эксперимента заключается в количественном измерении миграции клеток в режиме реального времени с помощью видеомикроскопии с временной задержкой (time-lapse). Для этого сначала шестилуночный культуральный планшет покрывают коллагеном, а затем на покрытый планшет высевают исследуемые клетки с низкой плотностью. На втором этапе с помощью наконечника пипетки в планшете создается «рана», чтобы обеспечить достаточное пространство для миграции.

Затем настраивается микроскоп и с регулярными интервалами производится захват изображений с использованием системы температурного контроля для непрерывного мониторинга миграции клеток в режиме реального времени. В конечном итоге используется протокол трекинга частиц для оценки различий в средней скорости и общем смещении тестовых и контрольных клеток. Основным преимуществом данного метода по сравнению с существующими способами, такими как анализ миграции в камере избегания, является то, что он не основан на количественных измерениях миграции в конечной точке.

Вместо этого данный подход позволяет непрерывно мониторить и рассчитывать различные параметры. Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы в области биологии рака, например, как определенные гены или препараты влияют на миграцию опухолевых клеток? За два дня до процедуры добавьте по 1,5 milliliters коллагена, разведенного в opti media, в каждую лунку культуральной пластины на шесть лунок, а затем инкубируйте пластину в течение ночи при температуре four degrees Celsius за один день до процедуры.

Ресуспендируйте интересующие клетки в 2 мл DMEM с добавлением FBS на каждую лунку и перенесите клетки в каждую лунку планшета, покрытого коллагеном ENC, затем инкубируйте клетки в течение ночи при 37 °C. В день проведения процедуры используйте наконечник пипетки, чтобы создать «рану» в клетках, культивируемых в течение ночи, и промойте каждую лунку PBS, чтобы удалить образовавшийся в результате повреждения клеточный детрит.

Добавьте DMEM с FBS в промытые лунки, затем проверьте под микроскопом, была ли создана чистая область раны. После включения камеры микроскопа и аппарата для визуализации живых клеток поместите планшет на предметный столик микроскопа. Накройте планшет новой камерой контроля окружающей среды для живых клеток, установите термостат на 37 °C, а уровень диоксида углерода — на 5%. Теперь откройте программное обеспечение для ведения журнала наблюдений в строке меню.

Выберите управление фокусировкой, нажав кнопку с буквой F в круге. В поле выбора объектива используйте выпадающее окно, чтобы определить объектив. В поле набора фильтров выберите настройки, чтобы направить световой путь на окуляр. Выберите соответствующий фильтр для светлого поля, а затем нажмите «Open Bright».

Откройте затвор светлого поля. Теперь выберите фильтр светлого поля на турели и посмотрите на образец через окуляр, чтобы найти подходящие поля зрения и сфокусироваться на образце. Затем переместите турель фильтров, чтобы перенаправить световой путь на камеру. Для захвата изображений в программном обеспечении slide book нажмите на управление фокусом (focus control), выберите XY, чтобы определить различные позиции через окуляр, а затем нажмите «установить точку» (set point), чтобы зафиксировать каждое положение.

Для захвата изображения вручную выполните точную настройку фокуса камеры, отображаемого на экране, затем с помощью инструментов в окне управления фокусом отрегулируйте положение предметного столика по оси Z. Для достижения наилучших результатов фокусировку следует проводить по плоским клеточным выростам вблизи места контакта с планшетом. Используйте ползунок для настройки времени экспозиции до достижения подходящего для фокусировки диапазона.

Если было выбрано несколько XY-позиций, настройте фокус для каждой отдельной позиции, используя управление фокусом. Затем перейдите в раздел xy, а затем выберите visit point. В SlideBook выберите значок камеры на панели меню, выберите тип захвата (capture type), а затем time lapse, чтобы задать общую продолжительность эксперимента.

В выпадающем меню введите желаемую задержку между началом одной временной точки и началом следующей. В полях интервала значение в третьем поле будет рассчитано автоматически на основе введенных вручную данных. В разделе многоточечного XY-захвата (multiple XY capture) выберите список многоточечного захвата (multi-point list) для экспериментов с более чем одной XY-позицией.

Наконец, укажите имя файла для сохранения, перейдите в панель управления захватом (capture control), выберите «advanced», затем «spool». После каждого временного интервала выполняйте захват в память (capture to memory) и сохранение в файл буфера (save to spool file). Начните с нажатия на изображение.

В строке меню книги слайдов выберите «import» из выпадающего списка, затем нажмите на «slide book spool». Выберите нужные файлы книги слайдов, полученные в результате эксперимента по миграции для различных полей и временных точек. Откройте первый файл, затем выберите «mask» в строке меню и выберите «particle tracking protocol» из выпадающего списка.

В меню отслеживания частиц выберите протокол ручного отслеживания частиц. Появится окно с начальной и конечной временными точками. Для анализа случайной миграции выберите «маску», а затем «протокол отслеживания частиц». Снова, чтобы определить координаты центра объекта, выберите «центр области».

Затем нажмите track и продолжите. Теперь выберите необходимые статистические показатели для каждой траектории, например, смещение и среднюю скорость. Как показано здесь, нажмите calculate, чтобы просмотреть статистику.

В данном блоке представлен пример анализа случайной миграции, количественно выраженной через скорость. На графике с «усами» показано, что в данном эксперименте наблюдалось увеличение средней скорости клеток M-D-A-M-B 2 31 с нокаутом гена супрессора опухоли. По сравнению с контрольными клетками M-D-A-M-B 2 31, случайная миграция клеток с первого рисунка здесь была проанализирована с точки зрения смещения клеток.

Снова в группе с общим нокдауном генов-супрессоров опухолей наблюдалось увеличение смещения клеток по сравнению с контрольной группой M-D-A-M-B 2 31. В данном видеоролике таймлапс-микроскопии контрольные клетки MDA MB 2 31 высаживали на коллаген на ночь. Затем изображения фиксировали с интервалом в один час в течение в общей сложности 18 часов в процессе случайной миграции.

Обратите внимание, как со временем клетки отдаляются от своих исходных позиций. В данном видео была записана и проанализирована миграция тестовых клеток M-D-A-M-B 2 31 после посева на коллаген с инкубацией в течение ночи. Заметьте, что тестовые клетки обладают более высокой миграционной активностью по сравнению с контрольными клетками из предыдущего видео.

После выполнения данной процедуры можно применить другие методы, такие как анализ инвазии клеток и dynas, чтобы ответить на дополнительные вопросы, например, о роли клеток в метастазировании рака после его развития. Данная методика открыла перед исследователями в области клеточной биологии возможность изучения миграции клеток с использованием изолированных линий раковых клеток.