Хронический изображений Мыши зрительной коры Использование тоньше черепа-подготовка

Дендритные шипики представляют собой выпячивания мембраны дендрита нейрона, которые принимают синаптические сигналы. Удлинение, сокращение, появление или исчезновение шипиков происходит в ответ на изменения в функционировании нейронной сети, вызванные специфическими паттернами нейронной активности. Это явление известно как кортикальная пластичность; оно позволяет наблюдать за морфологическими изменениями дендритных шипиков.

При работе с живыми животными на череп мыши закрепляют imaging plate. Определенный участок черепа подвергается хирургическому истончению, после чего делают снимки при малом и большом увеличении. Затем в эти же области проводят повторную визуализацию в более поздние моменты времени.

Полученные результаты показывают, что морфологию дендритных шипиков можно четко визуализировать с использованием метода тонкого preparations черепа в нескольких временных точках. Также было показано, что морфология шипиков весьма пластична, что проявляется в изменениях их структуры, а также в появлении и исчезновении дендритных шипиков. Здравствуйте, я Эмили Келли из лаборатории Анайи Мака на кафедре нейробиологии и анатомии в Университете Рочестера.

Сегодня мы продемонстрируем процедуру хронической визуализации коры головного мозга мыши после подготовки по методу «окна» (cranial window). Мы используем эту процедуру в нашей лаборатории для изучения обновления дендритных шипиков. Приступим к работе.

Начните процедуру со стерилизации инструментов для асептической хирургии. Затем стерилизуйте рабочую зону с помощью 70% ethanol и накройте операционную поверхность чистой стерильной салфеткой. Контролируйте глубину анестезии у мыши, наркотизированной коктейлем с фентанилом, проверяя ее реакцию на зажим пальца; на данном примере представлена трансгенная мышь A-G-F-P-M, в которой экспрессируется GFP.

В пятом слое находятся параметальные клетки, которые направляют дендритные отростки в поверхностные слои. Чтобы поддерживать температуру тела животного на уровне 37.5 °C, поместите его на греющий коврик и контролируйте температуру с помощью закрепленного ректального термометра. Затем, используя ножницы, нанесите офтальмологическую мазь на глаза, чтобы предотвратить их пересыхание.

Удалите шерсть с затылочной части головы мыши — от области за ушами до глаз. Затем очистите верхнюю часть головы животного, нанеся 70% ethanol, затем скраб Betadine и раствор Betadine. Сделайте разрез LCU за ушами и вверх вдоль правой или левой стороны от срединной линии (в зависимости от того, какое полушарие будет визуализироваться) до глаз, после чего отогните кожу в сторону от места проведения операции.

Не удаляйте кожу, так как позже она будет зашита с помощью тонких пинцетов. Осторожно оттяните кожу вверх и в сторону от исследуемой области. С помощью чистого пинцета аккуратно соскребите надкостницу с обнаженного участка черепа.

Нанесите небольшое количество 10% хлорида железа на череп, чтобы полностью высушить надкостницу и убедиться, что она была удалена полностью. Важно, чтобы череп был абсолютно сухим. Для обеспечения надлежащей адгезии клея аккуратно счистите остатки высушенной надкостницы микрохирургическим лезвием.

Затем нанесите тонкий слой акрилового клея Sano вокруг окна визуализации стальной головной пластины и закрепите пластину на черепе. С помощью деревянного конца ватной палочки нанесите клей на внутренние швы окна визуализации, стараясь заполнить все зазоры между пластиной и изгибом черепа. Поместите каплю ускорителя отверждения клея в окно.

Затем быстро удалите излишки. Дайте клею полностью высохнуть. Используя стоматологическую бормашину с установленным стальным бором диаметром 0.7 millimeter, начните истончать череп в окне визуализации.

Чередуйте сверление с периодическим нанесением 0,9% sterile saline, чтобы избежать чрезмерного перегрева черепа. Сформируйте окно размером 4×4 мм на черепе, используя короткие штрихи по поверхности кости.

С помощью стоматологического бора. Проверьте толщину черепа тупым концом пинцета. При легком нажатии поверхность черепа немного прогнется.

Оптимальная толщина черепа для визуализации составляет от 10 до 30 микрон. После истончения черепа очистите окно от всех частиц мусора и нанесите физиологический раствор на череп. Сфотографируйте окно визуализации с помощью цифровой камеры, установленной на диссекционном микроскопе.

Сосуды головного мозга на данной фотографии помогут определить место размещения imaging plate для последующих сеансов визуализации. Перенесите животное на установку для двухфотонной микроскопии. Животное должно оставаться на нагревательном коврике; температуру тела необходимо постоянно контролировать на протяжении всего сеанса визуализации.

Двухфотонный микроскоп с лазером Mi Tai. Для обеспечения максимальной мощности используется твердотельный насос мощностью 10 Вт, а также модифицированный конфокальный блок Olympus Flow View. Система оптимизирована для глубокой визуализации тканей; внешние детекторы установлены максимально близко к объективу для обеспечения максимального детектирования флуоресценции мозга. Добавьте каплю физраствора в окно визуализации, используя низкий цифровой зум.

С помощью цифровой камеры, закрепленной на микроскопе, определите область, содержащую ярко меченые нейроны. Затем сделайте фотографию области визуализации. Это необходимо для возврата в ту же точку визуализации на последующем этапе исследования.

Снимите серию снимков с малым увеличением по всей видимой области мозга, чтобы отобразить степень разветвления дендритов. Это позволит определять область визуализации в последующие моменты времени, так как и кровеносные сосуды, и дендриты сохраняют свою структуру у молодых и взрослых животных с помощью программного обеспечения для визуализации.

Увеличьте цифровое увеличение в восемь раз, при необходимости скорректируйте координаты XY и соберите стек изображений с высоким увеличением, который позволит детально рассмотреть морфологию дендритов, включая расположение и структуру дендритных шипиков. Подробно зафиксируйте данные о каждом собранном стеке, включая координаты панорамирования, диапазон сбора, размер шага по оси Z и количество шагов в стеке. Эти заметки понадобятся при повторном анализе данного дендрита или аксона в последующий момент времени.

После завершения визуализации снимите головную пластину, осторожно отделив её от поверхности черепа с помощью пинцета. Удалите остатки клея и протрите череп 0.9% стерильным физиологическим раствором.

Зашейте кожу над черепом, используя шовную нить номер шесть. После завершения процедуры визуализации протрите данную область 70% ethanol. Поместите животное в чистую клетку под лампу-обогреватель до тех пор, пока оно не проснется и не восстановит подвижность.

Затем верните животное в исходную клетку, чтобы повторно провести визуализацию через определенный промежуток времени — от двух дней до нескольких месяцев. Удалите швы и снова вскройте кожу на голове. Используя асептические методы, ориентируйтесь по цифровому изображению сосудистой сети головного мозга, полученному во время первой операции, чтобы найти исходное место визуализации. Затем снова зафиксируйте головную пластину, как и в первый раз.

При необходимости используйте микрохирургический скальпель, чтобы осторожно истончить слой кости, которая могла нарость между моментами визуализации. Выполните истончение с помощью стоматологического бора, очистите окно визуализации от остатков тканей и нанесите каплю 0.9% стерильного физиологического раствора. Перенесите животное к двухфотонному микроскопу и найдите исходную область визуализации, используя цифровое флуоресцентное изображение, полученное во время предыдущего сеанса.

Запустите программу просмотра потока. Откройте исходное изображение с низким увеличением, приложите прозрачный лист к экрану компьютера и обведите основные сосуды с помощью маркера по прозрачной пленке. Затем откройте изображение в режиме реального времени и совместите сосудистую сеть с рисунком на прозрачной пленке.

Уберите прозрачную пленку, чтобы повторно визуализировать структуры с восьмикратным увеличением. Откройте нужный стек изображений, собранный в ходе предыдущего сеанса визуализации. Обведите структуру на прозрачной пленке, закрепленной на экране компьютера.

Увеличьте изображение в реальном времени в 8 раз и совместите его с прозрачной пленкой. В зависимости от точности совмещения при малом увеличении может потребоваться немного скорректировать угол наклона изображения. Установите координаты панорамирования в соответствии с параметрами визуализации первого дня, включая размер шага и количество собираемых изображений в Z-стеке. Повторную визуализацию можно провести дважды. Количество вскрытий скальпа следует ограничить, чтобы избежать нарушения целостности черепа, что приведет к низкому разрешению изображений у мышей, экспрессирующих GFP.

Здесь с помощью двухфотонной лазерной сканирующей микроскопии in vivo были визуализированы подмножество параметальных клеток пятого слоя и соответствующие дендритные отростки; показаны дендриты зрительной коры, меченные GFP. Это изображение представляет собой проекцию серии снимков, полученных с шагом в 5 µm от поверхности PIA до конечной глубины 175 µm. Область, выделенная рамкой, показана с большим увеличением здесь в день 0 и снова в день 4; приведено сравнение изображений дендритной ветви с большим увеличением в день 0 и день 4.

На этих изображениях белыми стрелками показаны стабильные шипики, красными — ретрактирующие (исчезающие) шипики, а зелеными — новые шипики. Мы продемонстрировали вам метод проведения хронической двухфотонной визуализации зрительной коры мыши с использованием подготовки с истонченным черепом. При выполнении этой процедуры важно помнить о необходимости соблюдать особую осторожность в процессе истончения, чтобы избежать повреждения черепа и лежащей под ним твердой мозговой оболочки, так как это приведет к низкому разрешению изображений, а также следует вести подробные записи.

На этом всё. Спасибо за просмотр и удачи в ваших экспериментах.