Процедура Краниотомия хирургии при хроническом изображений мозга

Методы визуализации приобретают все большее значение в изучении функций мозга. Среди них двухфотонная лазерная микроскопия зарекомендовала себя как чрезвычайно полезный метод, поскольку она позволяет исследовать живой мозг при соответствующей подготовке образцов. Данная техника позволяет осуществлять хроническое наблюдение за одной и той же областью коры в течение периодов от нескольких минут до нескольких месяцев.

В этом видео мы демонстрируем подготовку к хронической визуализации мозга in vivo с помощью двухфотонной микроскопии. Доктор Карл Вода, исследователь Медицинского института Говарда Хьюза в Janelia Farm, изначально разработал метод установки краниального окна, который мы продемонстрируем сегодня. Здравствуйте, я Рикардо Муст из лаборатории Карлоса Портер-Кайо на кафедре неврологии Калифорнийского университета в Лос-Анджелесе.

Сегодня мы продемонстрируем процедуру создания краниального окна для хронической визуализации in vivo. Данная методика очень полезна, так как она позволяет проводить визуализацию глубоких структур головного мозга с помощью двухфотонного лазерного микроскопа. Итак, приступим.

Перед началом хирургического вмешательства мышей анестезируют изофлураном: 4% для индукции и 1,5–2% для поддержания наркоза во время операции, используя процедуры, одобренные комитетом IACUC. Важно использовать щипковый тест (сжатие хвоста и/или пальцев лапы), чтобы убедиться в полной седации животного. С помощью триммера для грызунов выбривают шерсть от затылка до области глаз.

После бритья мышь помещают на стереотаксическую раму на одеяло с рециркуляцией воды, нагретое до 37 °C; голову надежно фиксируют с помощью ушных зажимов. Затем наносят глазную мазь, чтобы предотвратить пересыхание глаз животного. После этого подкожно вводят дексаметазон в дозе 0.2 mg/kg и карпрофен в дозе 5 mg/kg.

Это необходимо для предотвращения отека мозга и/или воспалительной реакции соответственно. Перед началом операции обязательно стерилизуйте операционное поле, протирая кожу тремя чередующимися тампонами с 70% alcohol и Betadine. Все хирургические инструменты были предварительно стерилизованы в стеклянном бисерном стерилизаторе, а ножницы обработаны этанолом.

Кожу с верхней части черепа удаляют, начиная с горизонтального разреза вдоль основания головы, затем делают два разреза в ростральном направлении, почти до самых век. Далее следуют два косых разреза, сходящиеся по средней линии. На этом этапе на надкостницу наносят каплю раствора лидокаина и эпинефрина, чтобы избежать чрезмерного кровотечения; затем с помощью скальпеля надкостницу осторожно отодвигают к краям черепа.

Мышечные ткани задней части шеи также слегка ретрагируют. Затем всю открытую область черепа аккуратно зачищают скальпелем для создания сухой поверхности. Это крайне важно, так как в дальнейшем это обеспечит лучшую адгезию клея при его нанесении.

После выбора участка для визуализации можно приступать к созданию краниального окна. С помощью пневматической стоматологической бормашины осторожно выпиливается круг диаметром около четырех миллиметров. После небольшого высверливания на поверхность черепа снова наносится раствор лидокаина с эпинефрином.

Сверление прекращают, когда остается очень тонкий слой кости, обычно толщиной с один волос. Этот этап определяется путем осторожного нажатия на центр краниотомии, чтобы почувствовать, как кость подается под каплей физиологического раствора, а также по состоянию костных трабекул — губчатой структуры кости.

Трепанационный лоскут осторожно приподнимают над черепом с помощью пинцета с очень тонкими кончиками. Использование физиологического раствора важно, так как он способствует отделению кости и предотвращает кровотечение из твердой мозговой оболочки. Затем на твердую мозговую оболочку накладывают гемостатическую губку, предварительно смоченную в физиологическом растворе, чтобы остановить возможные мелкие кровотечения, которые иногда возникают при удалении фрагмента черепа.

После просушивания поверхности твердой мозговой оболочки и убедившись в отсутствии кровотечения, на нее аккуратно накладывают стерильное пятимиллиметровое стеклянное покровное стекло. Каплю клея на основе цианоакрилата наносят на череп противоположного полушария. С помощью иглы клей осторожно распределяют по всему периметру окна, следя за тем, чтобы он не попал под стекло.

Теперь можно нанести тонкий слой клея на всю поверхность черепа. После высыхания клея смешивают стоматологический акрил и наносят его на поверхность черепа, захватывая также небольшой край покровного стекла для его фиксации. После закрепления покровного стекла с помощью стоматологического акрила вокруг окна формируется небольшая лунка.

В стоматологический акрил также встраивают титановую планку. Эта планка в дальнейшем будет использоваться для надежной фиксации мыши на предметном столике микроскопа. Для проведения визуализации важно убедиться, что планка расположена ровно, чтобы она была параллельна краниальному окну.

Размещение листа бумаги под шиной позволяет ей оставаться в горизонтальном положении во время затвердевания акрила; стоматологическому акрилу дают полимеризоваться или затвердеть в течение 10 минут, после чего титановая шина фиксируется на месте. Затем животное помещают в теплую клетку до полного восстановления. После выхода из наркоза визуализацию животного можно провести в тот же день.

В данном видео представлен стек из 160 изображений, полученных с интервалом в 5 мкм с помощью нашего модифицированного двухфотонного микроскопа через краниальное окно, установленное над соматосенсорной корой трехмесячной мыши линии GFPM. У этой трансгенной линии мышей GFP экспрессируется в небольшой подгруппе пирамидных нейронов. Снимки пятого, второго и третьего слоев были получены с использованием объектива с иммерсией в воду 40x и числовой апертурой 0.8 при длине волны возбуждения 910 нм.

На более поверхностных изображениях легко распознать дендритные разветвления апикальных дендритов параметальных клеток. Апикальный пучок дендритов каждого нейрона сходится в один крупный апикальный дендрит. Также видны более мелкие косые дендриты, отходящие от этого основного апикального дендрита; заметны и аксоны, пересекающие поле зрения.

Это стек из 12 изображений, полученных с шагом в 1,5 микрон с использованием того же объектива 40x при большем увеличении; поверхностный дендрит показан с разрешением, достаточным для визуализации отдельных дендритных шипиков. Мы только что продемонстрировали вам, как выполнить установку краниального окна для хронической визуализации мозга с помощью двухфотонной микроскопии. Это чрезвычайно мощный метод исследования мозга, поскольку он позволяет изучать как структуру, так и функции живого мозга не только в рамках одного сеанса визуализации, но и хронически, проводя многократные исследования на протяжении нескольких месяцев.

Еще одним преимуществом подготовки краниального окна является возможность получения изображений с широким полем зрения, что позволяет визуализировать крупные структуры, такие как весь аксон или дендритное дерево, на протяжении нескольких миллиметров. При выполнении данной процедуры важно помнить о необходимости работы в максимально чистых и стерильных условиях, а также о необходимости твердой руки. Итак, на этом всё.

Благодарим за просмотр и желаем успехов в ваших экспериментах.