Оценка функции сердца и энергетика в изолированном сердце мыши, используя ³¹ P ЯМР-спектроскопии

Общая цель следующего эксперимента заключается в наблюдении за функцией и энергетикой сердца в изолированном перфузируемом сердце мыши. Это достигается путем перфузии сердца мыши в режиме LOR. На втором этапе, используя буфер Кребса-Хентер, обогащенный глюкозой и пируватом, в левый желудочек (LV) вводится заполненный водой баллон, что позволяет осуществлять постоянный мониторинг сердечной функции в ходе эксперимента.

Затем сердце помещают в ЯМР-трубку диаметром 10 миллиметров и вводят в магнит для оценки сердечной энергетики путем наблюдения за резонансами фосфокреатинов и неорганического фосфата; полученные результаты позволяют судить о функции и энергетике сердца на основе волн давления в ЛЖ, спектроскопии 31P ЯМР и масс-спектрометрии. Здравствуйте, я Стив Китц из Центра метаболизма сердца MIT при кафедре анестезиологии Вашингтонского университета. Сегодня я продемонстрирую вам процедуру перфузии изолированного сердца в сочетании с 31P ЯМР-спектроскопией.

Мы используем эту процедуру в нашей лаборатории для оценки функции сердца и энергетического обмена в наших биоинженерных моделях мышей. Итак, приступим. Для начала данного протокола приготовьте один литр буфера Kres-Henseleit или KH-буфера.

Продувайте смесь пузырьками 5% carbon dioxide и 95% oxygen в течение 10–15 минут. Затем добавьте две миллимоляр calcium chloride, после чего введите субстраты: 10 миллимоляр glucose и 0.5 миллимоляр pyruvate. В данных экспериментах для получения каждого P 31 спектра одновременно используются две отдельные системы.

Магнит BRUER 14 Т подключен к консоли advanced three и компьютеру с программным обеспечением top spin V 2.1 для оценки сердечной функции. Специально разработанная система перфузии сердца подключена к системе PowerLab. Четыре модуля сбора данных 30.

Для анализа данных используется программное обеспечение lab chart PRO six. Аппарат для перфузии сердца включает перистальтический насос mini pulse three, управляемый контроллером насоса STH, который используется для перфузии буфера KH в сердце. Регулирование температуры во время эксперимента ЯМР имеет решающее значение. Для поддержания температуры в диапазоне от 37.0 до 37.5 °C, пока сердце находится внутри магнита, используются нагревательные циркуляторы; на протяжении всего эксперимента температура контролируется с помощью оптоволоконного температурного зонда.

На протяжении всего эксперимента давление в ЛЖ и перфузионное давление контролируются с помощью датчиков давления, подключенных к системе сбора данных, с отображением показателей через соответствующее программное обеспечение. Для мониторинга давления в ЛЖ используется физиологический датчик, а для контроля перфузионного давления — одноразовый датчик артериального давления. Наконец, для подачи подогретого оксигенированного буфера к сердцу используется пупочный катетер.

Оказавшись внутри магнита, перед началом эксперимента откалибруйте датчики давления с помощью эталонного манометра: сначала создайте нулевое давление на датчике, чтобы обнулить калибровку. Затем накачайте в манометр более высокое давление. Введите это значение в компьютерную программу.

Затем убедитесь, что датчики давления откалиброваны надлежащим образом, надув этот манометр до известных значений давления и проверив их на экране компьютера. После калибровки датчиков давления откалибруйте ЯМР-зонд, используя ЯМР-трубку диаметром 10 мм, содержащую стандартный образец фосфата натрия с концентрацией 150 мМ. Выполните калибровку с помощью программного обеспечения TopSpin.

Сначала настройте образец, чтобы установить частоту резонанса фосфора. Затем проведите шиммирование образца для создания однородного магнитного поля. Эта предварительная калибровка усиливает сигнал и сокращает время, необходимое для начала периода сбора данных.

После того как сердце будет помещено в зонд для начала процедуры извлечения сердца мыши, введите мыши 200 единиц гепарина внутрибрюшно для снижения коагуляции. Через пять минут введите 175 миллиграммов на килограмм пентобарбиталя натрия внутрибрюшно. Как только мышь будет анестезирована, положите ее на спину и зафиксируйте передние и задние конечности скотчем, чтобы открыть область грудной клетки.

Проведите тест на болевую чувствительность (щипок пальца лапы), чтобы убедиться в полной анестезии мыши. Сделайте разрез. Вскройте ножницами брюшную и грудную полости, затем с помощью пинцета отогните ребра, чтобы обнажить грудную полость. Придерживая легочную ткань, осторожно приподнимите сердце изогнутыми ножницами.

Перережьте крупные сосуды за сердцем и медленно продвигайтесь в сторону головы мыши, пока сердце не будет полностью освобождено. Немедленно остановите сердцебиение, погрузив орган в ледяной буфер KH. Держите органы на льду и быстро извлеките легкие.

Определите доли тимуса и осторожно отогните их, чтобы обнажить аорту. Затем удалите тимус. В завершение изолируйте аорту, аккуратно удалив все окружающие ткани.

С помощью микрохирургического зажима для швов зафиксируйте обе стенки аорты, чтобы открыть просвет. Затем осторожно наденьте аорту на канюлю. Канюля изготовлена из полиэтиленовой трубки с наружным диаметром 0.965 millimeter.

Зафиксируйте аорту микрососудистым зажимом и быстро завяжите лигатуры вокруг аорты. После завязывания лигатур снимите зажим. С помощью пинцета осторожно убедитесь, что канюля находится выше корня аорты.

Наложите любые дополнительные лигатуры, необходимые для фиксации сердца. Удалите излишки тканей с помощью пинцета и микроножниц. Затем сделайте небольшой надрез в левом предсердии.

Аккуратно зажмите сердце и осторожно вставьте полиэтиленовую трубку с наружным диаметром 0.61 millimeter через левое предсердие, полость левого желудочка и выведите ее через верхушку. Обрежьте излишки трубки. Затем введите незаполненный баллон с водой через предсердие в левый желудочек.

Зафиксируйте баллон с помощью адгезивной ленты. Затем постепенно увеличивайте скорость перистальтического насоса, чтобы обеспечить достаточный кровоток в сердце. Продолжайте перфузию сердца буфером KH с постоянной скоростью потока примерно 2 мл/мин до помещения сердца в зонд ЯМР.

Наполните баллон левого желудочка (ЛЖ) небольшим объемом жидкости с помощью микродозирующего шприца, чтобы проверить работоспособность датчика давления в ЛЖ для ЯМР-спектроскопии. Сначала осторожно поместите сердце в 10-миллиметровую ЯМР-пробирку. Чтобы помочь правильно расположить пробирку, вокруг нее устанавливается ротор с широким отверстием.

Находясь внутри зонда, надежно закрепите весь аппарат на пуповине с помощью клейкой ленты. Затем медленно опустите пуповину в верхнее отверстие магнита, пока НМР-трубка с сердцем не окажется внутри катушки 10-миллиметрового НМР-зонда. Когда сердце примет правильное положение внутри зонда, отрегулируйте поток паразитного насоса, чтобы достичь давления перфузии 80 миллиметров ртутного столба.

Поддерживайте перфузионное давление, активировав механизм удержания (hold) на контроллере насоса. Дайте сердцу уравновеситься в течение 15–20 минут. В период уравновешивания отрегулируйте объем баллона левого желудочка (LV), чтобы достичь конечного диастолического давления 8–10 мм рт ст.

Затем оптимизируйте параметры спектрометра, чтобы получить максимально возможный сигнал фосфора. Настройте прибор ЯМР, установив радиоимпульс на частоту резонанса ядер фосфора. После периода уравновешивания выполните шиммирование образца для обеспечения однородности магнитного поля.

Приступите к многократному сбору спектров ЯМР ³¹P. Период сбора каждого спектра зависит от напряженности поля магнита, объема образца и отношения сигнал/шум, необходимого для конкретного эксперимента. В данном случае спектры получены с использованием магнита с индукцией 14 Tesla путем усреднения сигнала, полученного от 256 радиочастотных импульсов длительностью 20 microseconds с углом поворота 60 degree и задержкой 2.0 seconds.

Этот эксперимент займет примерно 10 минут. Типичный показатель сердечной функции — развившееся давление в левом желудочке (ЛЖ) — рассчитывается путем вычитания конечного диастолического давления (КДД) из систолического давления. У здоровой мыши линии C 57 black six развившееся давление в ЛЖ обычно составляет от 100 до 110 мм ртутного столба при фиксированном КДД от 8 до 10 мм ртутного столба.

Представлены репрезентативные кривые стилинга для контрольной группы и мышей с перевязкой аорты. Систолическая функция представлена зависимостью развиваемого давления в ЛЖ от увеличивающихся объемов ЛЖ, определяемых по объему баллона в ЛЖ. Диастолическая функция представлена зависимостью КДЛП от увеличивающихся объемов ЛЖ.

Спектры ЯМР ³¹P изолированного перфузионного сердца мыши содержат сигналы фосфокреатина (PHOSPHOCREATINE или PCR), трех фосфатных групп ТФ (TP) и неорганического фосфата (inorganic phosphate или pi). В данном случае пик PI относительно мал. Это характерно для сердца при аэробной перфузии с подачей пирувата или жирных кислот.

Помимо глюкозы, в периоды ишемии этот пик увеличивается, в то время как пик ПЦР снижается. Я только что продемонстрировал вам, как подготовить сердце мыши к перфузии, чтобы в ходе эксперимента можно было одновременно измерить как функцию сердца, так и энергетику. Важно убедиться, что сердце перфузировано надлежащим образом.

В противном случае данные ЯМР не будут достоверными. На этом всё. Благодарим вас и желаем успехов в ваших экспериментах.