NADH флуоресценции изолированных бивентрикулярной рабочей Кролик сердца

Общая цель данной процедуры заключается в изучении метаболизма. С помощью визуализации NADH в подготовке работающего сердца эта задача решается путем предварительного выделения сердца кролика. Вторым этапом процедуры является успешная канюляция всех четырех камер сердца для создания модели работающего сердца.

Заключительным этапом является настройка оборудования для визуализации и сбор данных об NADH при различных частотах стимуляции. В конечном итоге результаты позволяют выявить метаболические изменения в сердце путем визуализации флуоресценции NADH. Основным преимуществом данного метода по сравнению с существующими подходами, такими как лангендорфская ретроградная перфузия, является то, что сердце функционирует в физиологическом состоянии с потоком в нормальном направлении, при этом сердце самостоятельно обеспечивает давление для коронарной перфузии.

Данный метод может помочь в поиске ответов на ключевые вопросы электрофизиологии и механизмов возникновения летальных аритмий. Это достигается путем создания физиологической модели для изучения связи между метаболизмом коронарного кровотока и электрической активностью. Визуальная демонстрация этого метода имеет критическое значение, так как этапы канюляции сосудов и камер сердца трудно освоить.

Неправильная техника может привести к повреждению сердца и поставить под угрозу весь остальной эксперимент. Перед началом эксперимента промойте все трубки в камерах работающей системы сердца очищенной водой, затем удалите воду из системы с помощью насосов. Установите фильтры с целлюлозной мембраной в линии насоса перфузии LOR, насоса перфузии левого сердца и насоса перфузии правого сердца.

После подключения системы Perfuse 8 выполните двухточечную калибровку каждого датчика давления. Включите водяную баню с подогревом и циркуляцией, которая обеспечивает нагрев трубок с водяной рубашкой и теплообменников. Включите водяную баню, используемую для нагрева системы Perfuse 8.

Включите насосы, которые циркулируют Perfuse Eight по замкнутому контуру, и включите циркуляционный бак для оксигенации Perfuse Eight. Убедитесь, что микроволоконный оксигенатор или гемофильтры подают 95% кислорода в Perfuse Eight при давлении 80 kPa. Наконец, убедитесь, что теплообменники поддерживают температуру циркулирующего Perfuse Eight.

При температуре 37 °C начните иссечение сердца, предварительно переведя систему жизнеобеспечения сердца в режим работы при постоянном давлении (режим LRF). После седации кролика установите давление в аортальном блоке в диапазоне от 50 до 60.

Введите пентобарбитал и гепарин либо в краевую вену ушной раковины, либо в латеральную подключичную вену на внутренней стороне задней конечности. Как только у кролика исчезнет болевой рефлекс, быстро раскройте грудную полость. Разрежьте перикард, зажмите аорту и извлеките сердце и легкие.

Легкие оставляют прикрепленными, чтобы облегчить выделение легочных вен. Затем наполните шприц 60 миллилитрами физиологического раствора и 200 единицами гепарина. Установите канюлю диаметром 5 мм и канюлируйте аорту.

Закрепите аорту на канюле с помощью шелковых нитей нулевого размера. Затем медленно нажмите на шприц, чтобы вымыть кровь через сердце. Подготовьте систему работающего сердца, сначала подключив сердце к аортальному блоку.

Поднесите коннектор под косым углом и дайте раствору Perfuse eight осторожно стечь из коннектора в канюлю, пока она присоединена. Это предотвращает попадание воздуха в аорту, тем самым исключая возникновение коронарных эмболов во время перфузии сердца в режиме постоянного давления (L endorf mode).

Удалите жир и соединительную ткань и найдите следующие сосуды: нижнюю и верхнюю полые вены, аорту, легочную артерию и легочные вены. Затем перевяжите верхнюю полую вену.

Перережьте легочную артерию чуть ниже места ее разделения на правую и левую легочные артерии. Оставшиеся сосуды представляют собой легочные вены. Соберите их в группу между сердцем и легкими и перевяжите их все одним швом.

Это критически важно по двум причинам. Во-первых, перевязывание сосудов, идущих к легким, предотвратит утечку после завершения канюляции. Во-вторых, необходимо изолировать обе полые вены VNA для последующей канюляции.

Теперь удалите легкие. Прорежьте отверстие подходящего размера в углу ушка левого предсердия и убедитесь, что оно заполнено раствором perfuse eight. Затем канюлируйте ушко, предварительно полностью заполнив канюлю раствором perfuse eight.

Затем, удерживая ткань, пришейте канюлю к ушку. Ткань ушка левого предсердия крайне нежная и может легко порваться. Поэтому важно установить канюлю в левое предсердие с первой попытки, иначе это может оказаться невозможным.

Включите насос номер два для обеспечения потока в левое предсердие. На протяжении всего эксперимента поддерживайте преднагрузку в диапазоне от 2 до 6 tor. Возможно, потребуется отрегулировать давление.

Поддерживайте давление в пределах двух миллиметров от целевого значения. Теперь переведите сердце в рабочий режим, кратковременно выключив насос номер один (насос Лангора). Снизьте аортальное давление до 10 mmHg, а затем медленно поднимите его до диапазона 80–100 mmHg.

Это позволяет аортальному клапану открываться и функционировать так же, как при нормальных физиологических условиях. С помощью канюли, подключенной непосредственно к системе, установите конечное давление постнагрузки на значение, которое примерно на 20 Tore меньше пикового давления в ЛЖ.

Установите канюлю в правое предсердие через нижнюю полую вену и пришейте канюлю к вене. Избегайте попадания пузырьков воздуха. Включите насос номер три (насос правой стороны), чтобы обеспечить кровоток в правое предсердие.

Установите давление примерно на три торр. В завершение выполните каннюляцию правого желудочка, не допуская попадания воздуха, и зашейте канюлю в легочной артерии. На этом бивентрикулярная каннюляция завершена.

Теперь перейдите к регистрации сигнала. Осторожно введите катетер датчика давления в аорту через канюлю аорты. Аккуратно проведите его через аортальный клапан в левый желудочек (lv).

Сигнал давления в ЛЖ будет отображаться должным образом при правильном позиционировании кончика катетера. Затем осторожно прижмите электрод для регистрации монофазного потенциала действия к эпикарду желудочка. Небольшой двигательный артефакт в сигнале электрода является нормальным явлением.

Затем поместите биполярный стимулирующий электрод на правое предсердие для стимуляции сердца в соответствии с позицией, предусмотренной дизайном эксперимента. Сфокусируйте ПЗС-камеру на интересующей области сердца. К камере должен быть прикреплен эмиссионный фильтр.

Для регистрации флуоресценции NADH выключите окружающее освещение, чтобы равномерно осветить эпикард источником УФ-излучения на рабочей станции, к которой прикреплена камера. Настройте программное обеспечение для получения изображений с частотой два кадра в секунду. Затем выберите режим обновления в реальном времени для мониторинга средней интенсивности пикселей в пределах выбранной области интереса.

Если перфузия была достаточной, уровни NADH, определяемые по флуоресценции, должны быть низкими и стабильными по всей поверхности эпикарда. По завершении эксперимента остановите его. Извлеките сердце.

Промойте PERFUSE eight, трубки и камеры системы очищенной водой. Периодически промывайте систему раствором для трансмиссии миокарда (TM) или разбавленным раствором перекиси водорода согласно описанному протоколу. Стимуляция сердец проводилась с частотой от 200 до 400 ударов в минуту.

Диастолическое LVP обычно составляло от 0 до 10 тор, при этом минимальное диастолическое давление в аорте составляло примерно 60 тор. Пиковое систолическое LVP зависит от давления наполнения и сократимости и в оптимальном варианте должно находиться в пределах от 60 до 80 тор; при этом максимальное давление в аорте и максимальное LVP должны быть очень близки. Монофазные потенциалы действия, типичные для сердца кролика, имеют фазу быстрой деполяризации и характерную фазу реполяризации. Потенциалы действия легко регистрировались в препаратах, однако обычно сопровождались небольшим артефактом движения во время диастолы.

Для мониторинга изменений окислительно-восстановительного состояния митохондрий в течение трех циклов стимуляции при длительности цикла 300, 200 и 150 мс (когда частота стимуляции была близка к синусовому ритму) измерялись средние значения флуоресценции NADH в выбранной области интереса, отмеченной красной рамкой. Базовый уровень NADH оставался относительно постоянным при сокращении длительности цикла. При значениях ниже 300 мс базовый уровень NADH повышался, при этом наибольший рост наблюдался при 150 мс; сигнал осциллирует синхронно с сокращением, и частота осцилляций соответствует частоте сердечных сокращений.

Амплитуда этих осцилляций всегда была меньше любых долгосрочных тенденций, вызванных ишемией или гипоксией. Флуоресцентная визуализация NADH высокого разрешения всей передней поверхности при 200 ударах в минуту была постоянной и пространственно однородной при 400 ударах в минуту. Уровни NADH существенно повысились во всем эпикарде.

Наблюдалась значительная пространственная неоднородность, при этом наибольшее увеличение происходило в перегородочных областях ПЖ и ЛЖ. После освоения данная методика может быть выполнена менее чем за 45 минут при условии правильного проведения. При выполнении данной процедуры важно помнить о необходимости предотвратить попадание пузырьков воздуха в аорту или левое предсердие после завершения процедуры.

Для решения дополнительных задач, например, для установления связи между электрической и метаболической активностью на поверхности сердца при таких патологических сценариях, как локальная ишемия после её развития, могут быть использованы дополнительные методы, такие как введение в сердце вольтаж-чувствительного красителя. Эта методика открыла исследователям в области физиологии сердца возможность изучать метаболизм сердца и нарушения проводимости при патологических состояниях, используя более физиологически релевантную модель.