Pseudofracture: острая периферическая модель травмы тканей
18 апреля 2011 г.
Pseudofracture, воспроизводимые мышиной модели стерильной опорно-двигательного аппарата травмы, позволяет для оценки позднем сроке посттравматического иммунного ответа. В этой статье описываются процедурные исполнения модели шаг за шагом, в том числе потенциал для экспериментальных комбинаций модель позволяет изучать множественные травмы.
При переломе длинной кости, такой как бедренная или большеберцовая, поврежденные мышцы и мягкие ткани подвергаются воздействию обломков кости и костного мозга. За этим следует мощный иммунный ответ, способствующий восстановлению тканей. Модель для изучения последствий этого воздействия может быть создана путем забора обеих бедренных и большеберцовых костей.
От мыши-донора. Кости измельчают для получения костного раствора, который затем вводят в поврежденное бедро мыши-реципиента. Затем мониторируют иммунные ответы и оценивают повреждения удаленных органов, чтобы изучить долгосрочные последствия травмы, вызванной переломом.
Основное преимущество данного метода по сравнению с существующими моделями травмы периферических тканей, такими как модель двустороннего перелома бедренной кости, заключается в том, что эта модель — модель псевдоперелома — обеспечивает длительное выживание без осложнений, связанных с продолжительной анестезией или сложными методами фиксации переломов, и, следовательно, позволяет изучать иммунные ответы в отдаленном периоде после травмы. Перед началом процедуры подготовьте следующие принадлежности: ведерко со льдом, Бетадин, хирургические инструменты, гемостаты GRE, ступку и пестик, пинцет, иглы 20-го калибра, шприц объемом 1 CC, PBS, средства для анестезии и носовой конус для изофлурана. Одну эвтаназированную особь, соответствующую по возрасту и весу.
Генно-донорской мыши должно быть достаточно для обеспечения тремя реципиентами. Прикрепите донора к плексигласовой доске с помощью ленты, стараясь фиксировать нижние конечности только за кончики лап. Осторожно выбрейте шерсть на нижних конечностях.
Затем полностью обработайте их Betadine и спиртом для обеспечения стерильности. Чтобы извлечь длинные кости из нижней конечности, сделайте хирургический разрез кожи в паховой области, после чего продолжите рассечение кожи вдоль всей конечности до лодыжки; раздвиньте кожу и отделите ее от подкожной фасции и мышц как с медиальной, так и с латеральной стороны. Затем введите одно лезвие ножниц под мышцы, расположенные кпереди и латеральнее большеберцовой кости. Перемещайте лезвие проксимально и дистально, чтобы аккуратно отделить мышцы от подлежащей кости.
Повторите эту процедуру на задней и медиальной сторонах нижней части большеберцовой кости, чтобы отделить мышцы, расположенные под ней. При смещении в дистальном направлении на задней стороне следует прилагать минимальные дополнительные усилия, чтобы отделить малоберцовую кость от большеберцовой в проксимальном отделе этих мышц голени. Перережьте сухожилия как можно ближе к местам их прикрепления и отведите мышцы дистально, потянув за всю мышечную группу вниз; легкий рывок позволит освободить дистальные крепления от голеностопного сустава. С помощью ножниц перережьте ткани в области голеностопного сустава.
На данном этапе не отделяйте большеберцовую кость от бедренной, так как это соединение обеспечивает дополнительный рычаг, который облегчит отдел бедренной кости от тазобедренного сустава. Используйте аналогичную технику для освобождения мышц от бедренной кости. Выполните это сзади, а также с медиальной и латеральной сторон, если это необходимо.
Перережьте дистальные крепления этих групп мышц, чтобы освободить их от коленного сустава. При необходимости расширьте разрез кожи для обеспечения достаточного обзора, следуя под мышцами. Чтобы выделить конец бедренной кости из тазобедренного сустава, извлеките бедренную кость вместе с прикрепленной большеберцовой костью донорской мыши и поместите их на стерильную марлю.
Разделите две кости в коленном суставе, просто захватив каждую кость отдельной рукой и осторожно повернув или провернув их в противоположных направлениях вдоль их продольных осей. Чтобы удалить оставшиеся прикрепления сухожилий с длинных костей, оберните кость по всей длине кусочком марли размером 4 на 4 дюйма. Крепко зажмите и несколько раз проведите по всей длине костей, чтобы счистить остатки тканей с поверхности.
Поместите собранные кости в стерильную микроцентрифужную пробирку объемом 1.5 мл на льду. Перенесите кости донора в тщательно продезинфицированный шкаф биологической безопасности для приготовления костного раствора.
В вытяжном шкафу следует подготовить стерильную салфетку, стерильную ступку с пестиком, стерильный пинцет, стерильную пробирку объемом 8 мл, стерильный PBSA, дозатор на 1 мл с соответствующими наконечниками, дозатор на 100 мкл с соответствующими наконечниками, шприцы объемом 1 мл и иглы 20G. С помощью пинцета перенесите кости в ступку и осторожно измельчите их пестиком. Пипетотните 1 мл PBS в ступку и продолжайте растирать оставшиеся фрагменты круговыми движениями для обеспечения полной суспензии.
Затем добавьте еще 1 мл PBS и продолжайте растирание до получения костного раствора, который должен иметь розовый оттенок. Медленно перелейте раствор из ступки в пробирку объемом 8 мл, следя за тем, чтобы крупные остатки остались в ступке. Перенесите костный раствор в шприц объемом 1 мл.
Используя иглу 20-го калибра, поддерживайте раствор кости на льду. Пипетируйте 1 µL раствора кости на чашку с агаром МакКонки, равномерно распределяя его по поверхности. Инкубируйте чашку в течение 24–48 часов для проверки стерильности.
Начните хирургическую процедуру по моделированию повреждения мягких тканей и инъекции костного раствора с оценки глубины анестезии мыши, введенной пентобарбитал, путем сжатия пальца лапы. Поместите мышь в положение на спине на плексигласовую доску и иммобилизуйте животное, неплотно обмотав дистальные отделы каждой конечности тонкими полосками скотча липкой стороной наружу; перед этим выбрейте шерсть в области живота, паха и бедер, используя машинку для стрижки Oster с насадкой № 40.
Перенесите мышь в стерильную операционную зону. Протрите область хирургического вмешательства раствором Бетадина. Затем протрите ее спиртом для стерилизации.
Поместите на нос мыши конус, содержащий кусочек марли с одним миллилитром 99% изофлурана. Как только дыхание животного начнет замедляться, снимите конус. Если на любом этапе процедуры потребуется дополнительная анестезия, можно ввести дополнительную дозу пентобарбитала или применить изофлуран.
Затем сложите стерильную полевую повязку и накройте ею мышь так, чтобы были открыты только нижние конечности и голова. Данная модель повреждения мягких тканей представляет собой двусторонний раздавливающий перелом задних конечностей. Убедитесь, что мышь расположена так, чтобы задние конечности были слегка отведены и ротированы латерально.
Это облегчает доступ к нужной мышце. Сгруппируйте мышцы-сгибатели колена для нанесения раздавливающей травмы. Зажмите большой гемостат длиной 18 сантиметров вокруг мышц задней поверхности бедра в средней точке бедренной кости так, чтобы выпуклая сторона была обращена к бедренной кости. Зафиксируйте гемостат одним щелчком ровно на 30 секунд.
Введите иглу через кожу на два-три миллиметра так, чтобы кончик скоса только коснулся бедренной кости. Введите 0,15 мл костного раствора в раздробленную мускулатуру бедра с каждой стороны. Извлеките иглу и быстро прижмите к месту инъекции палец в стерильной перчатке, чтобы предотвратить обратный ток костного раствора из раны.
Удерживайте палец в этом положении в течение нескольких секунд. Поместите мышь обратно в клетку и обеспечьте ей полную свободу передвижения сразу по мере прекращения действия анестезии. Необходимо обеспечить соответствующее купирование боли при пробуждении мыши.
На данной общей схеме показан двухфазный иммунный ответ после травмы в нулевой временной точке. Индуцируется травма. Затем следует ранняя гипервоспалительная реакция, пик которой приходится на шесть часов; она оценивается путем анализа системного воспаления и дисфункции отдаленных органов.
Вторым компонентом постревматического иммунного ответа является отсроченная иммуносупрессия, оцениваемая по дисфункции иммунных клеток, которая на графике представлена в виде спада примерно через 48 часов. На данной репрезентативной диаграмме показан ответ воспалительных цитокинов в плазме, возникающий в ранний период после травмы, что служит примером системного воспаления. В аналогичный промежуток времени наблюдается повышение показателей дисфункции отдаленных органов, определяемой по повреждению печени.
Данная репрезентативная схема приведена в качестве примера, чтобы продемонстрировать дисфункцию иммунных клеток в поздний период после травмы. При выполнении данной процедуры важно помнить о необходимости обеспечения стерильности и точности манипуляций на протяжении всего эксперимента. Данная схема не является моделью истинного перелома или инфекции раны.
Просмотрите полный транскрипт и получите доступ к тысячам научных видео
Обзор
В данной статье представлена мышиная модель стерильной скелетно-мышечной травмы, известная как псевдоперелом, которая позволяет оценивать поздние постревматические иммунные ответы. Подробно описывается процедура выполнения данной модели, а также подчеркивается возможность ее сочетания с другими экспериментальными методами для изучения множественных травм.
Основные компоненты исследования
Область науки
- Нейронауки
- Иммунология
- Исследования травм
Теоретические основы
- Псевдоперелом представляет собой модель, имитирующую скелетно-мышечную травму.
- Она позволяет изучать иммунные ответы после повреждения.
- Понимание этих ответов имеет решающее значение для разработки терапевтических стратегий.
- Данная модель может быть объединена с другими экспериментальными установками для проведения комплексных исследований.
Цель исследования
- Оценить иммунные ответы после скелетно-мышечной травмы.
- Создать воспроизводимую модель для будущих исследований.
- Изучить влияние комбинированной травмы на иммунные ответы.
Используемые методы
- Забор бедренных и большеберцовых костей у мышей-доноров.
- Измельчение костей для получения костного раствора.
- Инъекция раствора в поврежденное бедро мышей-реципиентов.
- Мониторинг иммунного ответа и оценка повреждений отдаленных органов.
Основные результаты
- Продемонстрирован выраженный иммунный ответ на повреждение кости.
- Выявлены долгосрочные эффекты травмы, вызванной переломом.
- Показан потенциал для изучения различных сценариев травм.
- Получены данные о механизмах восстановления тканей.
Выводы
- Псевдоперелом является ценной моделью для изучения иммунных ответов после травмы.
- Данная модель может быть использована в различных экспериментальных комбинациях для расширения исследований.
- Дальнейшие исследования могут привести к совершенствованию терапевтических подходов при лечении травм.
Часто задаваемые вопросы
Практическая значимость для промышленности
Мышиная модель псевдоперелома позволяет воспроизводимо исследовать острые и поздние иммунные ответы на стерильную травму периферических тканей, восполняя критический пробел в трансляционных исследованиях травм. Ее конструкция позволяет обойти технические ограничения и проблемы с выживаемостью, характерные для традиционных моделей переломов, что способствует проведению долгосрочных механистических исследований, имеющих значение для иммунологического снижения рисков и валидации мишеней. Данная модель предназначена для использования на этапах раннего поиска и доклинической оценки иммуномодулирующих стратегий в рамках портфелей по лечению травм и восстановлению тканей.
Стратегическое применение в биофармацевтических исследованиях и разработках
Ранние этапы поиска и валидация мишеней
- Позволяет исследовать индуцированные травмой иммунные пути с использованием генетически определенных линий мышей.
- Обеспечивает механическое снижение рисков путем моделирования как гипервоспалительной, так и иммуносупрессивной фаз после травмы.
- Способствует функциональной валидации мишеней для иммуномодуляторов в контролируемой, воспроизводимой системе.
Скрининг и разработка анализа
- Обеспечивает стандартизированную масштабируемую платформу для оценки иммунологических биомаркеров и биомаркеров повреждения органов после травмы тканей.
- Позволяет проводить воспроизводимые количественные измерения системного воспаления и дисфункции отдаленных органов.
- Обеспечивает разработку методов анализа дисфункции иммунных клеток на поздней фазе и профилирования цитокинов.
Трансляционные и доклинические исследования
- Соответствует моделям травм, имеющим значение для конкретных заболеваний, что позволяет проводить доклиническую валидацию кандидатов на иммунотерапию.
- Позволяет проводить лонгитюдные исследования иммунного ответа и повреждения органов, что способствует поиску трансляционных биомаркеров.
- Облегчает принятие решений о дальнейшем продвижении разработок с учетом рисков за счет моделирования клинически значимых осложнений травм.
Интеграция конвейера и рабочего процесса
Данная модель связывает этапы первичных открытий и доклинических исследований, обеспечивая возможность проверки гипотез об иммунных ответах на травму и способствуя последующей валидации биомаркеров и терапевтических методов.
- Открывающая биология: Позволяет проверять нулевые гипотезы о механизмах иммунного ответа и задействованных сигнальных путях при травме.
- Скрининг: Обеспечивает воспроизводимые количественные показатели конечных точек иммунного ответа и повреждения органов.
- Аналитика: Позволяет проводить статистическое сравнение иммунных ответов при различных экспериментальных условиях и во временных точках.
- Трансляционные исследования: Моделирует клинически значимую иммунную дисфункцию и повреждение органов для сопоставления с биомаркерами.
- Корпоративное повторное использование: Представляет собой многократно используемую стандартизированную платформу для изучения травмы, адаптируемую к различным генетическим фонам и комбинациям экспериментов.
Операционное и корпоративное воздействие
- Научная ценность: повышает достоверность прогнозов при валидации иммунных мишеней и снижении механистических рисков.
- Операционная ценность: повышает воспроизводимость и масштабируемость долгосрочных исследований травм.
- Стратегическая ценность: оптимизирует принятие решений о продолжении или прекращении (go/no-go) иммуномодулирующих программ, направленных на борьбу с осложнениями после травм.
- Влияние на портфель: обеспечивает приоритетность активов в области травматологии и иммунологии с учетом скорректированных рисков.
Особенности реализации
- Требуется опыт в проведении хирургических операций на мышах и иммунологических анализах.
- Необходим доступ к стерильной хирургической и аналитической инфраструктуре для анализа тканей и биомаркеров.
- Требуется строгая стандартизация между исследовательскими группами для обеспечения воспроизводимости и сопоставимости данных.
- Метод применим к различным линиям мышей, включая трансгенные и нокаутные линии, для исследований специфических сигнальных путей.
- Данная модель не подходит для изучения инфекций или истинных переломов, что ограничивает ее прямое применение для достижения инфекционных или ортопедических конечных точек.
