Генома анализа с использованием чип-изоформы Определить конкретные цели Гена

Общая цель следующего эксперимента заключается в идентификации геномных мишеней KDM5A (KDM5A), гистон-деметилазы RBB2. Для этого на первом этапе подготавливают сшитый хроматин, который затем подвергают соникации для получения фрагментов ДНК соответствующего размера. На втором этапе фрагменты ДНК, связанные с RBB2, иммунопреципитируют с помощью антител к RBB2.

Затем выделенная геномная ДНК амплифицируется с помощью ПЦР для последующего секвенирования. В завершение короткие прочтения, полученные методом секвенирования Illumina, уникально выравниваются по геному человека, после чего идентифицируются значимые пики и привязываются к ближайшим генам. Для идентификации двух целевых генов rbbb получены результаты, демонстрирующие молекулярные функции, связанные с двумя целевыми генами Rrb B, на основании общегеномной идентификации обогащенных регионов Rbbb два.

Здравствуйте, я Майк из лаборатории доктора Элизабет Бенсии с кафедры биохимии и молекулярной генетики Иллинойсского университета в Чикаго. А я Ала из лаборатории биомедицинской геномики под руководством доктора НГА в биомедицинском исследовательском парке BARCEL Университета PO P fea.

А я Даниэль Дал. А я Уильям Рихтер. Мы оба также работаем в Лаборатории навыков Benevolence.

Сегодня мы продемонстрируем процедуру иммунопреципитации хроматина с последующим секвенированием. В нашей лаборатории мы используем этот метод для изучения сайтов связывания гистондеацетилазы. Итак, приступим.

Для начала данной процедуры вырастите примерно 10⁸ клеток на каждую иммунопреципитацию (ip). В данном случае используются клетки диффузной остеолитической лимфомы.

Клетки U 9 37 используют и индуцируют для моноцитарной дифференцировки с помощью TPA в течение 96 часов после роста клеток, добавляя раствор формальдегида непосредственно в среду до конечной концентрации 1%. Затем осторожно перемешайте колбу круговыми движениями и оставьте их при комнатной температуре на 10 минут. После этого аспирируйте среду и промойте клетки 15 миллилитрами ледяного PBS. Повторите промывку один раз.

Затем добавьте по 6 mL лизирующего буфера 1 в каждую колбу на льду. После этого инкубируйте колбы в течение 20 минут при 4 °C в режиме покачивания. В завершение соберите клетки с помощью клеточного скребка и перенесите их в конические пробирки объемом 15 mL.

На данном этапе клетки можно хранить при температуре -80 °C. Если клетки были заморожены, разморозьте их. После размораживания центрифугируйте клетки и удалите супернатант.

Затем ресуспендируйте клетки в шести миллилитрах лизисного буфера 2 и осторожно перемешивайте пробирки на ротаторе при комнатной температуре в течение 10 минут. Повторите центрифугирование и ресуспендируйте клетки в 2,5 миллилитрах лизисного буфера 3. Затем подготовьте суспензию к соникации, поместив ее в стакан с ледяной водой; используйте микронасадку соникатора Branson 450, установив амплитуду в диапазоне от 50 до 60%.

Подвергните раствор ультразвуковой обработке короткими импульсами продолжительностью 32-х секунд с последующим охлаждением на льду. В течение одной минуты повторите эти циклы от 10 до 15 раз, затем несколько раз пропипетируйте содержимое пробирки и перенесите его в новую пробирку. Продолжайте чередовать импульсное воздействие и охлаждение раствора.

После пяти дополнительных циклов соникации добавьте 10% Triton X 100 в объеме, составляющем одну десятую от объема раствора. Затем перенесите лизаты в центрифужные пробирки объемом 1,5 мл и удалите клеточный дебрис с помощью микроцентрифугирования перед проведением иммунопреципитации хроматина или ChIP. Сохраните 50 µL клеточного лизата в качестве контрольного образца (input).

Затем смешали осветленный лизат клеток с dyna-гранулами, связанными с антителом, которые были предварительно подготовлены согласно описанному в письменном протоколе методу. Смесь, включая контрольный образец объемом 50 µL, перемешивали на ротаторе при температуре 4 °C в течение ночи. Промыли гранулы 1 мл промывочного буфера.

Затем с помощью магнитного штатива соберите гранулы и удалите супернатант. Повторите эту промывку от шести до восьми раз. Выполните финальную промывку с использованием 1 mL TE и 50 mM NaCl.

После центрифугирования осадите гранулы в микроцентрифуге и аспирируйте остатки буфера TE. Затем сразу же добавьте в образцы 100 µL элюирующего буфера.

Инкубируйте образцы при 65 °C в течение 10–15 минут. Каждые две минуты осторожно постукивайте пробирками о штатив для пробирок объемом 1,5 мл, чтобы поддерживать бусины во взвешенном состоянии. Соберите бусины с помощью центрифугирования и магнитного штатива, затем перенесите супернатант в ПЦР-пробирку.

Затем извлеките ранее сохраненный контрольный образец (input) и добавьте три объема элюционного буфера. В завершение поместите образцы после иммунопреципитации (IP) и контрольные образцы в термоциклер на ночь при температуре 65 °C. На следующий день для разрыва поперечных сшивок добавьте в образцы один объем буфера TE.

Затем добавьте РНК А до конечной концентрации 0,2 мкг/мкл. Инкубируйте образцы в термоциклере в течение одного-двух часов при 37 °C. После инкубации добавьте протеиназу К до конечной концентрации 0,2 мкг/мкл.

Затем инкубируйте образцы в термоциклере при 55 °C в течение двух часов. Далее проведите первую экстракцию образцов одним объемом фенола. Проведите повторную экстракцию образцов одним объемом смеси фенол-хлороформ-изоамиловый спирт.

В завершение повторно экстрагируйте образцы одним объемом смеси хлороформа и изоамилового спирта. Затем добавьте в каждый образец 30 µg гликогена. Также добавьте хлорид натрия до конечной концентрации 0.2 M и два объема этанола в образцы.

Инкубируйте их в течение 30 минут при температуре -80 °C. После инкубации центрифугируйте образцы и слейте супернатант. Промойте осадок 500 µL 75% этанола, затем высушите осадок и ресуспендируйте его в 40 µL воды.

Чтобы проверить размер фрагментов ДНК, полученных в результате процедуры СОНИКАЦИИ, нанесите пять микрограмм очищенного исходного образца на 1,8% агарозный гель и проведите электрофорез. В результате соникации должны быть получены фрагменты размером от 150 до 350 пар оснований. Если фрагменты не попадают в этот диапазон, перед амплификацией геномной ДНК следует скорректировать процедуру соникации, изменив количество импульсов и амплитуду.

Проверьте размер, концентрацию и степень обогащения образцов в соответствии с письменным протоколом. Для начала амплификации геномной ДНК возьмите 34 µL образца IP и 200 ng контрольного образца (input). Выполните добавление а-хвоста и лигирование адаптеров к фрагментам ДНК с использованием набора для подготовки образцов геномной ДНК Illumina, как описано в письменном протоколе.

Очистите ДНК с помощью набора для мини-очистки продуктов ПЦР, затем элюируйте ее в буфере EB, предварительно нагретом до 50 °C. Используйте 23 µL и 46 µL для образцов IP-ДНК и входной ДНК соответственно. Проведите реакцию ПЦР, используя 23 µL ДНК с адаптерами, 25 µL смеси и ДНК-полимеразу из набора.

Добавьте 1 µL 20 мкМ праймера PCR one и 1 µL 20 мкМ праймера PCR two. Проведите ПЦР-реакцию согласно описанному в письменном протоколе методу. После амплификации ПЦР очистите ДНК с помощью набора Qiagen mini loop PCR purification kit.

Предварительно нагрейте 15 µL буфера EB до 50 °C, разведите ДНК образца в соотношении 1:4 (0,5 µL образца) и проведите измерение на NanoDrop для очистки продуктов амплификации. Приготовьте 1,8% AGROS-гель объемом 50 мл, используя воду степени чистоты HPLC, добавив TAE и бромид после расплавления AGROS. Затем залейте гель и внесите в него образцы.

После добавления четырех µL буфера для нанесения в образцы входного контроля (input) и иммунопреципитирования (IP), проведите электрофорез в геле при 120 В в течение 45 минут. Проанализируйте гель после завершения разделительного процесса. Результаты должны показать образование фрагментов в диапазоне от 150 до 350 пар оснований.

Они представляют собой фрагменты геномной ДНК длиной от 50 до 250 пар оснований. С помощью скальпеля вырежьте из геля область, содержащую материал в диапазоне от 150 до 350 пар оснований. Будьте осторожны, чтобы не вырезать полосу адаптера, которая соответствует примерно 120 парам оснований.

Выделите ДНК с помощью набора для экспресс-экстракции из геля Kayak в соответствии с инструкциями производителя. Высушите образец до точного объема 11 µL в спидбике без нагрева. Отберите 1 µL образца и измерьте концентрацию ДНК с помощью спектрофотометра NanoDrop.

Наконец, идентифицируйте обогащенные генные продукты с помощью геномного анализатора Illumina и проанализируйте сайты связывания и гены-мишени, как описано в письменном протоколе. Геномные координаты идентифицированных обогащенных областей связывания белка RB два или RBP два представлены в формате по каждой хромосоме. Заполненность ансамблевых генов в хромосомах может быть визуализирована в виде черных полос.

Здесь показана степень заполнения хромосомы 10; области связывания RBP2 представлены в виде вертикальных линий. На средней панели показаны области связывания всех изоформ RBP2 на хромосоме 10, а на нижней панели — области связывания большой изоформы RBP2. Эта информация дает общее представление о перекрывающемся и специфическом связывании изоформ RBP2 на хромосоме 10.

Здесь представлена тепловая карта категорий молекулярных функций генной онтологии (GO), которые были значительно обогащены среди генов, с которыми связывается rbp, с поправкой на ложноположительный результат (FDR). Цвета, близкие к красному, указывают на высокую статистическую значимость. Желтый цвет указывает на низкую статистическую значимость, а серый — на отсутствие статистической значимости.

Анализ обогащения демонстрирует перекрывающиеся и изоформ-специфичные молекулярные функции двух целевых генов R BP. Мы только что показали вам, как идентифицировать сайты связывания транскрипционных факторов в ходе данной процедуры. Важно получить фрагменты ДНК соответствующего размера и выхода.

Этого можно добиться, следуя нашим рекомендациям на этапе СОНИКАЦИИ. На этом всё. Желаем удачи в ваших экспериментах и спасибо за просмотр.