Роман байесовского Изменение точки Алгоритм всему геному анализ различных типов данных ChIPseq

Общая цель следующего эксперимента заключается в использовании плотности позиций картированных ридов, полученных в результате секвенирования после иммунопреципитации хроматина, для оценки апостериорного среднего значения плотности ридов по всему геному. Это достигается путем предварительной обработки картированных ридов ChIP-seq в профили блоковой плотности, при которой в каждом неперекрывающемся интервале (бине) размером 200 пар оснований содержится одинаковое количество ридов.

На втором этапе любые соседние корзины с одинаковой плотностью объединяются в более крупный блок; затем рекурсивно рассчитываются апостериорные средние плотности каждого блока в контексте всех окружающих блоков с использованием байесовской модели с прямым и обратным фильтрами. При этом количество чтений для блока моделируется с помощью распределения Пуассона с параметром тета, который имеет гамма-распределение априорной вероятности с параметрами альфа и бета. Далее оценки апостериорной средней плотности каждого блока проверяются на значимость: определяется, превышает ли она 90-й квантиль относительно плотности фонового контроля входного сигнала для формирования окончательных результатов обогащенных сегментов генома. В итоге получаются результаты, иллюстрирующие процесс перехода от необработанных секвенированных чтений к оценкам апостериорной средней плотности чтений и, наконец, к обогащенным «островкам» в данных ChIP-seq в ходе анализа BCP.

Кроме того, результаты показывают, что BCP превосходит конкурирующий инструмент cer. Основным преимуществом данной методики перед существующими методами, такими как CER, является то, что в BCP использованы последние достижения в области скрытых марковских моделей, что позволяет более точно описывать нюансы анализа данных chipsy, чем предыдущие эвристические методы. Этот метод может помочь в решении ключевых вопросов в области эпигеномики, таких как роль модификаций гистонов, путем характеристики паттернов их обогащения в масштабе всего генома.

Хотя данный метод ориентирован на анализ данных ChIP-seq, эта базовая структура может быть применена и к анализу других данных секвенирования следующего поколения, таких как идентификация дифференциально метилированных регионов в данных бисульфитного секвенирования, поиск новых транскрипционных локусов в RNA-Seq, определение вариаций числа копий или анализ любых данных плиточного микрочипа. Визуальная демонстрация этого метода имеет решающее значение для четкого понимания методологии и ее преимуществ. Теоретические преимущества скрыты в программном обеспечении.

Все представленные здесь этапы процедуры были объединены в один исполняемый файл в программном пакете BCP, который доступен для скачивания в данном видео. Для запуска программы приведено описание выполняемых ею действий. Требуется указать три параметра.

Файл, содержащий уникально картированные риды из образца ChIP, и аналогичный файл для контрольных ридов (input), а также имя выходного файла для подготовки входных файлов для анализа BCP. Сначала выровняйте короткие риды, полученные в результате секвенирования, по соответствующему референсному геному, используя предпочтительное программное обеспечение для выравнивания коротких ридов. Координаты картирования должны быть преобразованы в шестиколоночный формат BED (Browser Extensible Data), где каждая строка с разделителем-табуляцией соответствует одному картированному риду и содержит информацию о картированной хромосоме, начальной позиции, конечной позиции, имени рида, значении score и направлении нити.

Доведите координаты чипа и карты ввода до заранее определенной длины фрагмента. Например, до размера фрагмента, который задавался при ферментативном расщеплении или соникации ДНК, обычно около 200 base pairs. Затем количество фрагментов суммируется в соседних интервалах (бинах).

По умолчанию размер бина установлен в соответствии с расчетной длиной фрагмента, равной 200 base pairs. Любые возможные точки перелома в наборе бинов с идентичным количеством чтений, скорее всего, будут находиться на внешних границах. Соответственно, появление точки перелома на внутренней границе между двумя бинами с одинаковым количеством чтений маловероятно.

Таким образом, сгруппируйте соседние бины с одинаковым количеством ридов в один блок. После подготовки входных файлов запустите оценку BCP, просто введя команду, показанную в нижней части экрана. Плотность ридов каждого блока моделируется как распределение Пуассона с параметром среднего theta, который следует смеси гамма-распределений с параметрами alpha и beta, а также априорной вероятностью возникновения точки смены в любом блоке.

Ограничение P, задаваемое для каждого блока таким образом, фактически создает скрытую марковскую модель (HMM) с бесконечным числом состояний. Гиперпараметры alpha, beta и P оцениваются с помощью метода максимального апостериорного правдоподобия. Байесовские оценки theta sub T для каждого блока рассчитываются явно как математическое ожидание theta sub T при заданном значении why sub T. Более традиционные, но трудоемкие прямые и обратные фильтры, часто используемые в HMM, заменены более вычислительно эффективным методом аппроксимации смеси с ограниченной сложностью для оценки апостериорных средних theta hat sub T. Полученные апостериорные средние будут сглажены в приблизительный кусочно-постоянный профиль, поэтому блоки с идентичными значениями theta hat sub T должны быть дополнительно объединены с обновлением координат границ.

BCP использует количество входных прочтений на блок в качестве фонового уровня и определяет степень обогащения. Для этого применяется простой гипотетический тест, основанный на том, превышает ли средняя плотность позиций чипа для данного блока определенный порог значимости. Пороговым значением по умолчанию является 90-й квантиль, который подходит для большинства случаев.

Затем BCP объединяет смежные блоки с наибольшей апостериорной плотностью, превышающие уровень обогащения, в единую область и выводит координаты объединенных регионов в браузере. Расширяемый формат данных BCP отлично подходит для идентификации областей широкого обогащения в данных о модификациях гистонов. Здесь результаты BCP сравниваются с результатами cser — существующего инструмента, продемонстрировавшего высокую эффективность. Предыдущие работы данной лаборатории по изучению триметилирования H3K36 выявили тенденцию к значительно большему размеру «островков» в BCP по сравнению с cer.

Более крупные острова в большей степени соответствуют общепринятым ожиданиям относительно широких диффузных областей обогащения триметилированием H3K36. Однако наличие только более крупных островов не является единственным показателем точности. Следовательно, для оценки эффективности BCP и CER по сравнению с CER использовалась известная связь островов триметилирования H3K36 с телами активно транскрибируемых генов, а также их взаимная исключительность с островами триметилирования H3K27. BCP выявлял более крупные непрерывные острова, которые лучше охватывают тела генов, не увеличивая при этом степень перекрытия с островами триметилирования H3K27.

BCP обеспечивает высокую степень перекрытия активных генов с островами триметилирования H3K36, причем границы этих островов точно совпадают с телами генов, не увеличивая при этом частоту ложноположительного перекрытия с межгенными пространствами, генами с репрессированной транскрипцией или репрессивной меткой триметилирования H3K27; при оценке воспроизводимости определения островов с помощью BCP на двух повторных наборах данных было замечено, что BCP не подвержен сильной зависимости от глубины покрытия ридов, в отличие от конкурирующего алгоритма cser. Дополнительные доказательства надежности и воспроизводимости BCP получены путем анализа других отдельных регионов, что продемонстрировало стабильность границ островов даже при сниженной глубине покрытия. Чтобы в полной мере продемонстрировать универсальность BCP, был получен широкий спектр данных о модификациях гистонов, включая точечные метки H3K27-ацетилирование, H3K9-ацетилирование и H3K4-триметилирование, а также диффузную метку H3K9-триметилирование, в дополнение к H3K27-триметилированию и H3K36-триметилированию. Эти наборы данных были проанализированы с использованием параметров по умолчанию как для BCP, так и для cser.

В центре находится область обогащения триметилированием H3K36 в гене PXDN, что свидетельствует об активной транскрипции; ожидаемо в сайте начала транскрипции расположены дополнительные точечные метки активности: ацетилирование H3K27, ацетилирование H3K9 и триметилирование H3K4. Сразу за PXDN следует репрессированная межгенная область, характеризующаяся обогащением триметилированием H3K27; на противоположном фланге находится репрессированный триметилированием H3K27 ген. Перейдем на один шаг дальше.

Наш сайленсированный хроматин, на что указывает обогащение триметилированием H3K9, по-видимому, свидетельствует о сайленсинге SNTG2 и MYT1L, возможно, в более устойчивом смысле, чем репрессия посредством триметилирования H3K27. Этот регион охватывает большинство явлений, наблюдаемых при ChIP-seq модификаций гистонов. Он иллюстрирует, как динамическая природа BCP позволяет идентифицировать как точечные метки ацетилирования и триметилирования H3K4, так и одновременно различать крупные непрерывные острова репрессии вследствие триметилирования H3K27 и H3K9, а также активную транскрипцию с триметилированием H3K36.

Выполнение этого алгоритма занимает примерно 30 минут, в зависимости от количества чтений и результата анализа генома. В отличие от многих других методов, выполнение данной процедуры не требует значительной оптимизации. С помощью BBCP можно изучать множество различных целевых белков хроматиновой иммунопреципитации, включая различные модификации гистонов, а также ДНК-связывающие транскрипционные факторы для получения дополнительных ответов на вопросы об эпигеномных механизмах и регуляции генов.

После просмотра этого видео вы должны получить четкое представление о том, как BCP используется для определения регионов обогащения диффузных меток гистонов при анализе данных ChIP-seq.