Патч зажим Recordings от мыши нейронов сетчатки в темно-адаптированной фрагмент подготовка

Наше зрительное восприятие начинается, когда зрительный пигмент в фоторецепторах сетчатки поглощает фотоны световой энергии, что в конечном итоге приводит к закрытию циклических нуклеотид-зависимых каналов в клеточной мембране. Это подавляет высвобождение нейромедиатора глутамата как палочками, так и колбочками. Высвобождаемый глутамат воспринимается нижележащими клетками сетчатки для передачи последующих сигналов.

Глаза извлекают из эвтаназированной мыши. S изолируют, заключают в агаровый блок и нарезают с помощью вибрирующего микротома. Затем срезы сетчатки помещают под микроскоп и стимулируют светодиодным освещением.

В то же время проводятся записи методом локальной фиксации потенциала (patch clamp) для измерения генерируемых синаптических токов или потенциалов. Как правило, специалисты, только начинающие осваивать этот метод, сталкиваются с трудностями из-за дополнительных сложностей, связанных с работой в темноте. Поэтому возможность визуализировать весь процесс позволит получить практическое понимание, которое в противном случае трудно описать.

Начните выполнение данной процедуры с нанесения слоя хлорида серебра на регистрирующий и референтный проволочные электроды, которые будут использоваться в работе. Погрузите электроды в 1 M раствор хлорида натрия. Затем, используя источник питания 15 В с синусоидальным сигналом частотой 1 Гц, подайте между ними напряжение 15 В в течение примерно 20 секунд.

С помощью вытягивателя микропипеток изготовьте патч-пипетки из боросиликатного стекла, предварительно обработанного огневым полированием, выбирая сопротивление кончика пипетки в зависимости от размера целевых клеток: для тел клеток диаметром около 20 мкм используйте пипетку с сопротивлением кончика от 5 до 10 МОм, а для тел клеток диаметром около 5 мкм — с сопротивлением от 12 до 15 МОм.

Для подготовки заземляющих электродах-сравнения с помощью шприца заполните полиэтиленовую трубку 3,5% раствором агарозы, приготовленным в 1 мМ растворе хлорида натрия. Затем приготовьте следующие растворы согласно инструкциям в прилагаемом письменном протоколе: раствор для внешней ванны, раствор для срезов, внутренний раствор для пипеток с аспартатом калия и агарозную заглушку.

Храните все растворы при температуре 4 °C до их использования. В день проведения эксперимента добавьте примерно 1,5 mL внутреннего раствора аспартата калия. Затем добавьте разведенный Fluor.

Налейте около 50 мл среды Aims, содержащей бикарбонат натрия, в светонепроницаемый контейнер для хранения. Подсоедините пластиковую трубку к газовому баллону, содержащему 5% carbon dioxide и 95% oxygen, для уравновешивания среды Aims с газом, а затем поместите контейнер в водяную баню при температуре от 30 до 32 °C. Затем наполните флакон 110 мл среды Aims, содержащей HEPES, и поместите его на лед.

Доведите среду до равновесного состояния, продувая раствор 100% кислородом. Поместите оставшуюся среду Aimes, содержащую бикарбонат натрия, в термостат на верхней части клетки Фарадея. Обмотайте трубку и горлышко флакона парафильмом, чтобы удерживать газ в пространстве над раствором и уравновесить его смесью 5% углекислого газа и 95% кислорода.

С помощью стеклянной трубки для дисперсии воздуха приготовьте 3% агар с низкой температурой гелеобразования, добавив 0,75 граммов агара к 25 миллилитрам среды aims при нагревании. Раствор нагревают примерно до 115 °C при перемешивании. Когда раствор станет прозрачным и в нем не останется пузырьков, поместите расплавленный раствор агара в водяную баню с температурой 42 °C.

Установите регистрирующую камеру на инвертированный микроскоп. Наденьте пятисантиметровый агаровый мостик на хлорсеребряный электрод сравнения и поместите его в регистрирующую камеру. Сопротивление кончика пипетки можно измерить, заполнив пипетку внутренним раствором, установив её в держатель, поместив держатель в головку усилителя и опустив пипетку в раствор. Для сохранения зрительного пигмента при физиологической регистрации все процедуры следует проводить при инфракрасном освещении в инфракрасных очках, однако в данном видео все действия демонстрируются при обычном комнатном освещении.

После эвтаназии мыши быстро удалите глаза с помощью изогнутых ножниц. Положите глаза на кусочек фильтровальной бумаги, чтобы они не скатывались. Затем зафиксируйте глаз пинцетом и с помощью тонкого двухстороннего лезвия сделайте надрез в роговице.

Сразу после прокола глазного яблока перенесите глаз в чашку Петри диаметром 60 миллиметров, наполненную средой aims. Используя разрез в роговице в качестве точки входа, аккуратно вырежьте маленькими ножницами оставшиеся части роговицы.

Затем удалите хрусталик и стекловидное тело, следя за тем, чтобы сетчатка оставалась прикрепленной к глазной чаше. Поместите её в светонепроницаемый контейнер, заполненный средой aims, уравновешенной смесью 5% carbon dioxide и 95% oxygen при 32 degrees celsius.

Затем сделайте разрез по срединной линии одной из глазных чашечек, используя скальпель с лезвием №10. Отделите сетчатку от ретинального пигментного эпителия.

Обрежьте края сетчатки, чтобы ткань могла лежать плоско. С помощью небольшой стеклянной пастеровской пипетки с латексной грушей наполните чашку Петри диаметром 35 мм расплавленным агаром с низкой температурой застывания и проведите пинцетом по агару, чтобы проверить его консистенцию. Как только агар начнет затвердевать, перенесите сетчатку на поверхность агара.

Затем, не касаясь сетчатки, с помощью скрученного кусочка салфетки Kim wipe удалите излишки раствора вокруг нее. Нанесите еще две-три капли агара непосредственно на сетчатку и быстро установите пластический цилиндр, чтобы создать вокруг нее стенку; удерживая сетчатку ближе к центру цилиндра, долейте расплавленный агар, после чего перенесите чашку Петри в баню с ледяной водой для охлаждения. Через 30 секунд извлеките ткань и с помощью поршня вытолкните блок агара, надавливая со стороны, противоположной сетчатке.

С помощью одностороннего лезвия вырежьте небольшой блок агара, содержащий сетчатку, и приклейте этот блок суперклеем к агаровому ограничителю на диске для образцов. Перенесите диск для образцов в держатель вибротома и налейте в держатель ледяной раствор Aims, чтобы блок с сетчаткой был полностью погружен. Сделайте срезы сетчатки толщиной около 200 microns, используя максимальную частоту вибрации лезвия и установив такую скорость подачи, чтобы один срез сетчатки занимал от четырех до пяти секунд.

С помощью скальпеля с лезвием № 11 последовательно вырежьте каждый пригодный срез из блока. Поместите срезы, содержащие сетчатку, в регистрирующие камеры и зафиксируйте их. С помощью анкеров для срезов закрепите нейлоновые нити, пересекающие анкер.

Зафиксируйте агар вокруг сетчатки, чтобы она оставалась открытой. Для проведения записей перенесите измерительную камеру на предметный столик вертикального микроскопа.

Закройте занавеску и включите источник инфракрасного излучения, чтобы рассмотреть срез с помощью инфракрасной камеры. Под микроскопом найдите срез сетчатки с сохранными фоторецепторами, выполненный под соответствующим углом среза. Вследствие процесса нарезки могут быть заметны некоторые повреждения поверхности.

С помощью пипетки с обломанным кончиком осторожно отсосите погибшие тела клеток. Чтобы удалить этот тонкий слой клеток, после обнажения здорового слоя живых клеток найдите тело клетки, расположенное в интересующем вас слое. Переместите кончик пипетки так, чтобы он создал углубление в клеточной мембране, и приложите осторожное отрицательное давление (втягивание), чтобы создать герметичное соединение с высоким сопротивлением. Режим целой клетки (whole cell mode) достигается путем подачи отрицательного давления на электрод для прорыва мембраны клетки.

Затем стимулируйте ткань сетчатки светом с помощью светодиодов для вызова ответов. В конце записи сделайте снимок, используя соответствующий возбуждающий свет для флуорофора, который диализировался в клетку из внутреннего раствора пипетки. Здесь показаны вызванные светом потенциалы нейрона сетчатки, адаптированного к темноте, в ответ на вспышки света возрастающей интенсивности.

На этом рисунке представлено флуоресцентное изображение среза сетчатки, в котором клетки были заполнены флуорофором Lucifer yellow; вызванная флуоресценция демонстрирует морфологию клеток, в которых проводилась патч-регистрация. После просмотра этого видео вы получите лучшее представление о некоторых сложностях проведения патч-кламп регистрации в срезах сетчатки, адаптированных к темноте. Целью данной процедуры является измерение вызванных светом ответов при контролируемом освещении.

Для этого сначала необходимо выделить сетчатку, включить ее в агар, а затем подготовить срезы сетчатки, на которых можно будет проводить регистрацию активности отдельных клеток.