Патч-зажим измерения емкости и Са ^{2 +} Изображений на Одноместный нервных окончаний в сетчатке глаза Ломтики

Общая цель данной процедуры — подготовка срезов сетчатки, иммобилизованных в агаре, для изучения микроциркуляций, расположенных в пресинаптических нервных терминалях биполярных клеток. Для этого сначала извлекают сетчатку из глаза золотой рыбки, предварительно адаптированного к темноте, и вырезают из нее небольшой прямоугольный фрагмент. Затем фрагмент сетчатки погружают в прозрачный раствор агара с низкой температурой плавления, который затем затвердевает в охлажденном растворе для срезов.

Следующим шагом является нарезка твердого блока агара, содержащего прямоугольный фрагмент сетчатки, с помощью вибротома. Заключительный этап заключается в визуализации, идентификации и патч-клампировании терминали нерва биполярной клетки.

В итоге результаты демонстрируют пресинаптический кальциевый ток и синаптический физический экзоцитоз с измерениями емкости мембраны терминалей расщепленных и интактных биполярных клеток. Здравствуйте, меня зовут Хан Ким. Я постдок в лаборатории PCO в Институте Берхэма.

Сегодня я представлю метод подготовки эмбеддированных срезов холодной сетчатки лица AGA и продемонстрирую измерение емкости методом патч-клампа в одной трубке. Чтобы начать эту процедуру, разделите каждый глаз золотой рыбки пополам, равномерно разрезая переднюю часть глаза пружинными ножницами. Затем поместите чашечки глаз в охлажденный раствор для срезов без кальция.

При необходимости удалите хрусталик с помощью пинцета. Затем удалите пигментный эпителий, прикрепленный к сетчатке, отделяя сетчатку от глазного яблока с помощью тонкого пинцета с загнутыми под углом 45 градусов кончиками. После этого перережьте зрительный нерв тонким пинцетом или пружинными ножницами.

Затем проведите аспирацию с помощью модифицированной пасты-пипетки или большой наконечника-пипетки для переноса. Чтобы извлечь сетчатку, аккуратно удалите остатки пигментного эпителия, прикрепленного к ней. Поверхность очищенной и здоровой сетчатки должна выглядеть гладкой.

Затем обработайте изолированную сетчатку раствором IDE с концентрацией около 0.03% в течение 15–30 минут при комнатной температуре. Обратите внимание, что процедуру удаления стекловидного тела следует проводить при слабом освещении. На следующем этапе с помощью лезвия бритвы удалите изогнутые края и вырежьте прямоугольный фрагмент сетчатки размером примерно два на два миллиметра, включающий всю толщину ткани.

Затем перенесите фрагмент сетчатки в небольшой контейнер, наполненный раствором агара, стараясь минимизировать количество раствора вокруг сетчатки при ее помещении в жидкий агар. После этого погрузите сетчатку вместе с агаром непосредственно в ледяной раствор для срезов, чтобы агар затвердел. Затем вырежьте из затвердевшего блока агара, содержащего прямоугольный фрагмент сетчатки, куб размером 1х1х1 см.

Приклейте блок к поверхности нарезной пластины в камере для предварительного нарезания срезов. Затем нарежьте блок на срезы толщиной от 200 до 250 микрон в ледяном растворе для нарезания. С помощью вибратома можно получить от пяти до 10 срезов, которые остаются жизнеспособными в течение примерно пяти-шести часов.

После этого перенесите один из срезов в регистрирующую камеру. Поместите U-образную платиновую рамку с сеткой из нейлоновых нитей поверх среза. Обеспечьте непрерывную перфузию среза раствором для регистрации, насыщенным карбогеном, со скоростью от 1 до 2 мл/мин.

На данном этапе с помощью шприца с фильтрующим наконечником 0,2 мкм заполните стеклянную патч-пипетку внутренним раствором до уровня одного-двух сантиметров от заднего конца пипетки. Затем удалите пузырьки воздуха из наконечника. Надежно закрепите пипетку в держателе.

Создайте положительное давление в пипетке и с помощью микроманипулятора переместите ее к целевому терминалу, продвигая кончик вниз сквозь срез. Перемещайте пипетку боковыми sweeping-движениями, чтобы срез не тянулся вслед за кончиком. Затем обведите кончиком пипетки вокруг терминала, чтобы очистить поверхность мембраны.

Надавите кончиком вниз на край терминала, чтобы создать углубление, и сбросьте положительное давление. Если гигаомный seal не образовался сразу, создайте в пипетке небольшое отрицательное давление. После образования гигаомного seal переключите усилитель патч-клампа EPC-9 в режим записи on-cell и установите удерживающий потенциал на -60 или -70 мВ.

Примените быструю коррекцию емкости и дождитесь стабилизации сопротивления мембраны (seal) в диапазоне от 5 до 10 ГОм. Затем разгерметизируйте мембрану с помощью резкого, но осторожного всасывания для установления конфигурации записи из целой клетки.

Вместо шприца можно использовать ротовое всасывание. После установления конфигурации целой клетки на атомизированном терминале MB примените ступенчатую деполяризацию продолжительностью 200 миллисекунд от -70 до 0 милливольт. Помните, что до и после этой деполяризации в режиме фиксации потенциала (voltage clamp) подается синусоида с частотой 2 килогерца. Для измерения мембранной емкости деполяризация позволяет напрямую измерить входящие кальциевые токи, активируемые открытием потенциал-зависимых кальциевых каналов L-типа, при использовании внутреннего раствора на основе цезия.

Параллельно можно отслеживать скачок емкости, вызванный кальций-зависимым экзоцитозом синаптических везикул, который приводит к увеличению площади поверхности мембраны. Если применить метод локальной фиксации потенциала (patch-clamp) к интактной биполярной клетке MB, зафиксировав пипеткой синаптический терминал, заметных кальциевых токов наблюдаться не будет из-за больших токов утечки, возникающих вследствие взаимодействия через щелевые контакты в области биполярных клеток MB. Вместо этого наблюдается большой ток, напоминающий ток утечки, направленный наружу.

Тем не менее, по-прежнему можно контролировать скачок емкости с помощью высокочастотного синусоидального стимула, активируемого до и после показанного деполяризующего шага. Ниже представлены примеры I-R-D-I-C, изображения терминалей M-биполярных клеток. Интактные терминали, скорее всего, будут иметь эллиптическую форму, как показано на A и B, в то время как на C представлена смешанная терминаль, которая выглядит круглой.

Метод заполнения красителем также может быть использован для классификации терминалей клеток. Здесь представлены примеры флуоресцентных изображений терминалей биполярных клеток MBI с неповрежденным аксоном на рис. D, частично перерезанным аксоном на рис. e и полностью удаленным аксоном на рис. F. Их терминали отмечены синими стрелками. Здесь показаны прямые измерения сигналов кальциевого имиджинга экзоцитоза и тормозной обратной связи.

В терминали биполярной клетки MB кратковременный рост концентрации кальция в телерии терминали MB был активирован ступенчатой деполяризацией при фиксированном потенциале; соответствующее флуоресцентное изображение телерий MB представлено на рисунке B. Примеры кратковременной синаптической депрессии высвобождения нейромедиатора показаны на рисунке C. При выполнении данной процедуры важно помнить о необходимости минимизировать количество раствора вокруг сетчатки при ее помещении в агаровый кит. Это улучшит прикрепление Latinized к агаровому блоку.