Грамицидин основе флуоресценции Пробирной; для определения малых молекул Потенциал Изменение свойств липидного бислоя

Общая цель данной процедуры заключается в измерении вызванных препаратом изменений свойств бислоя, которые регистрируются белками, пересекающими бислой. Это достигается путем первоначального создания крупных односторонних везикул, нагруженных флуоресцентным красителем. Вторым этапом процедуры является введение грамина в везикулы.

Третьим этапом процедуры является добавление внешнего гасителя и измерение скорости гашения внутреннего флуорофора. Четвертый, заключительный этап процедуры заключается в количественной оценке изменения гашения флуоресценции в зависимости от активности грамина путем аппроксимации кинетики флуоресценции растянутой экспоненциальной функцией. В конечном итоге полученные результаты позволяют оценить, способны ли амфифильные молекулы изменять свойства липидного бислоя.

Здравствуйте, я Ола Андерсон. Здравствуйте, я Хелсон. Привет, я Ричи Капо.

А я — Лия Сэнфорд из лаборатории доктора Олафа Андерсона с кафедры физиологии и биофизики Медицинского колледжа Вейлл Корнелл. Сегодня мы продемонстрируем вам процедуру измерения изменений свойств липидного бислоя. Мы используем этот метод в нашей лаборатории для изучения влияния лекарственных препаратов и малых молекул на свойства липидного бислоя.

Итак, приступим. В первый день данной процедуры извлеките липиды из морозильной камеры и дайте им достичь комнатной температуры. После уравновешивания добавьте в круглодонную колбу объемом 25 мл 0,6 мл раствора липидов в хлороформе с концентрацией 25 мг/мл. Затем высушите раствор в потоке азота, непрерывно вращая колбу до полного испарения хлороформа.

Тонкая белая липидная пленка покрывает всю нижнюю половину колбы; дополнительно высушите липиды в эксикаторе под вакуумом в течение ночи. Приготовьте раствор 100 мМ нитрата натрия, 25 мМ ANTS и 10 мМ HEPES с pH 7. При корректировке pH этого раствора избегайте использования любых растворов, содержащих хлориды.

Поскольку на второй день таллий-гаситель образует нерастворимый комплекс с хлоридом, регидратируйте липиды в 1,67 мл данного электролитного раствора для получения 10 мМ суспензии липидов. После достижения нужной концентрации закройте пробирку парафильмом и тщательно перемешайте суспензию на вортексе, затем защитите образец от света фольгой и оставьте его для выдержки при комнатной температуре на ночь.

На третий день подвергните смесь воздействию ультразвука в течение одной минуты с использованием ультразвукового гомогенизатора низкой мощности. Затем проведите замораживание-оттаивание образца: пять минут на сухом льду, затем пять минут в теплой воде; повторите цикл замораживания-оттаивания четыре-пять раз. Пропустите липидную суспензию через мини-экструдер Avanti.

Подготовьте мини-экструдер, установив поликарбонатный фильтр с размером пор 0,1 мкм и опоры для фильтра; пропустите суспензию через фильтр туда и обратно 21 раз до тех пор, пока в противоположном шприце не окажется почти прозрачная суспензия, представляющая собой суспензию крупных одноламеллярных везикул (LUV). Удалите внешний АНТС, пропустив экструдированную суспензию через колонку PD 10, уравновешенную натриевым буфером. Добавьте в колонку 1,5 мл суспензии LUV и 1 мл натриевого буфера.

После полного введения раствора в колонку элюируйте липосомы тремя миллилитрами натриевого буфера и соберите элюат. Полученный стоковый раствор LUV, заполненных A NTS, должен содержать примерно четыре-пять миллимоляр липида и иметь полупрозрачный, молочно-белый вид.

Защитите раствор от света с помощью фольги и храните при 13 °C; за 24 часа до использования тщательно перемешайте на вортексе. Сток-раствор LUV, заполненный A NTS. Поскольку UUV имеют плотность более 1 g/mL, они могут выпадать в осадок.

Затем разбавьте исходный раствор LUV, заполненных A NTS, в соотношении 1:20 с использованием натриевого буфера. Инкубируйте три четверти липосом с 260 nanogram абидина в DMSO. В оставшуюся одну четверть добавьте такой же объем DMSO без грамина.

Для поддержания постоянной концентрации растворителя во всех образцах следует оставить грамин для уравновешивания между внутренним и внешним монослоями липидных везикул на 24 часа при 13 °C. Для измерения скорости тушения флуоресценции используется спектрофлуориметр с остановкой потока Applied Photophysics SX point 20 с контролем температуры. Перед началом работы включите приборы за час до проведения эксперимента, чтобы дать им прогреться.

Щель с репортерами для возбуждения должна быть установлена на 1/1, а для регистрации эмиссии с помощью программного обеспечения pro data SX следует использовать высокочастотный фильтр 455 нм. Сначала настройте условия регистрации, установив длину волны возбуждения монохроматора на 352 нм. Используйте настройку удержания давления.

Установите время на одну секунду, а количество точек — на 5 000. Установите число повторений на девять для прогонов с буфером и на 13 для прогонов с гасителем. Контролируйте температуру в профиле проверки привода (check drive profile) программного обеспечения Essex.

Объем подачи должен быть установлен на 120 µL, что обеспечивает смешивание по 60 µL из каждого шприца. Это дает мертвый период примерно 1,2 ms. Настройте высокое напряжение или усиление на флуоресцентном детекторе примерно на 420 V.

Цель состоит в том, чтобы получить показатель флуоресценции около восьми; уравновесьте предварительно подготовленные UUV, нагруженные A NTS, в течение 10 минут при 25 °C в темноте. После уравновешивания перемешайте образец на вортексе, затем загрузите его в левый шприц. В правый шприц загрузите либо натриевый буфер, либо Thallium Quencher.

Удалите все пузырьки воздуха, перемещая поршни шприцев вперед и назад. Оба шприца должны быть заполнены в равном объеме. Перед закрытием клапанов для самого первого образца измерьте флуоресценцию натриевого буфера.

Повторите процедуру четыре раза, при необходимости отрегулируйте усиление. Затем повторите ее еще пять раз для остальных образцов. Запишите результаты девяти повторов с натриевым буфером.

Замените натриевый буфер таллиевым гасителем и запишите 13 повторений. Промойте водой и перейдите к контрольным образцам следующей пробы. Включите образцы без грамина и с растворителем, а также образцы без грамина и с максимальной концентрацией соединения.

После проведения флуоресцентного анализа как для грамина, так и для растворителя, загрузите полученные данные в программное обеспечение MATLAB для анализа. Для каждого образца считываются все повторы для буфера и гасителя; первые четыре повтора будут загрязнены остатками предыдущих проб в трубках. В данном случае сигнал возникает из-за смешивания образца натриевого буфера с водой после предыдущей промывки.

Повторы с пятого по девятый представляют собой сигнал только от образца. Поэтому мы всегда исключаем первые четыре повтора в каждом случае. Чтобы избежать артефактов смешивания, вручную просмотрите трейсы и удалите все неудачные повторы, такие как красный трейс, содержащий спайки или отклонения, вызванные артефактами смешивания или пузырьками воздуха.

Затем нормируйте повторности гашения по среднему начальному значению повторностей буфера для каждого образца при каждом экспериментальном условии, объедините средние значения всех образцов в один график визуализации; образцы без грамицидина должны быть схожи и демонстрировать практически полное отсутствие гашения флуоресценции. В образцах с грамицидином наблюдается медленное снижение флуоресцентного сигнала из-за постепенного проникновения ионов таллия в везикулы. Если временной ход флуоресценции заметно изменяется под воздействием соединения, значит, при протестированной концентрации данное соединение изменяет свойства липидного бислоя; далее аппроксимируйте первые 2–100 мс кривых нормированного гашения флуоресценции с помощью растянутой экспоненты.

Для каждого отдельного повтора рассчитайте скорость при двух миллисекундах. Затем на основе данных отдельных повторов рассчитайте средние значения и стандартные отклонения для данного образца. Эффект капсаицина, обозначенного здесь как cap, наблюдался в динамике флуоресцентного тушения в отсутствие или присутствии грамина, обозначенного как ga; здесь показан нормированный флуоресцентный сигнал за одну секунду. Серые точки представляют результаты всех повторов, а красные линии — средние значения.

Представлены первые 100 milliseconds нормированного флуоресцентного сигнала. Серые точки соответствуют результатам одного повторения для каждого условия. Красные линии представляют собой аппроксимации этих повторений с помощью растянутой экспоненты.

Пунктирная синяя линия обозначает отметку в две миллисекунды. Это время, при котором определяется скорость тушения. Относительное изменение скорости тушения определяется путем нормирования данных относительно контрольного образца с грамином и без модификатора.

Когда капсаицин адсорбируется на липидном бислое, он изменяет его свойства. Смещение в сторону более мягкого бислоя отразится в виде сдвига грамм-стороны в равновесии «мономер-димер» в пользу проводящего димера. Мы только что продемонстрировали процедуру измерения эффектов воздействия малой молекулы на структуру бислоя.

При выполнении данной процедуры важно помнить о необходимости использования соответствующих контролей для каждого эксперимента с применением одной и той же партии везикул. На этом всё. Спасибо за внимание и успехов в ваших экспериментах.