Флуоресцентные Анализ Скрининг на выявление каналов модуляторы GIRK
24 апреля 2012 г.
В режиме реального времени процедура скрининга для выявления наркотиков, которые взаимодействуют с G белком закрытый внутренний выпрямитель K + (GIRK) каналов описана. Анализ использует мембранный потенциал-чувствительные флуоресцентные красители для измерения GIRK канал деятельности. Этот метод можно адаптировать для использования на нескольких клеточных линий.
Общая цель данной процедуры заключается в поиске новых лекарственных препаратов, модулирующих каналы grk. Для этого сначала клетки A TT 20 высевают в 96-луночный планшет. На втором этапе проводится разведение исследуемых соединений с помощью системы автоматического дозирования жидкостей Verset.
Затем разведенные исследуемые соединения наносятся на клетки с помощью версета. Заключительный этап заключается в том, чтобы поместить 96-луночный планшет в флуоресцентный планшетный ридер Synergy 2 и ввести контрольные растворы и растворы соматостатина в лунки. В итоге флуоресцентный планшетный ридер используется для выявления соединений, которые изменяют индуцированный соматостатином флуоресцентный сигнал и, таким образом, модулируют каналы Grk.
Преимущество данной процедуры перед существующими методами, такими как метод локальной фиксации потенциала (patch clamp), заключается в возможности быстрого скрининга большого количества соединений для определения того, модулируют ли они каналы Gerk. Значимость данной методики распространяется на лечение боли, поскольку позволяют идентифицировать соединения, активирующие канал Gerk, что приводит к подавлению ноцицептивной передачи в FI. Демонстрацию процедуры покрытия 96-луночных планшетов и посева клеток проводит Марибель Васкес.
Студент в моей лаборатории начинает выполнение данной процедуры с культивирования клеток гипофиза A TT 20 в среде DMEM с добавлением 10% лошадиной сыворотки при 37 °C в увлажненной атмосфере с 5% CO2. Поддерживайте культуру, перенося клетки в новые флаконы каждые пять-семь дней, используя стандартную процедуру пассирования. Затем покройте поверхность лунок черного прозрачного планшета.
Заполните 96-луночный планшет с плоским дном 50 µL поли-L-лизина. Дайте лункам высохнуть в течение 30 минут в инкубаторе. Затем удалите излишки поли-L-лизина и высейте клетки в 96-луночный планшет, содержащий 200 µL среды, с плотностью 30 000 клеток на лунку.
После этого поместите клетки в инкубатор на три-четыре дня. С помощью системы аспирации медленно удалите культуральную среду из монослоя клеток, затем промойте клетки 200 µL обычного буферного раствора. Впоследствии добавьте в каждую лунку по 200 µL буферного раствора, содержащего краситель, чувствительный к мембранному потенциалу.
Инкубируйте клетки в течение 40 минут при 37 °C. По истечении 40 минут извлеките клетки A TT 20 из инкубатора, дайте им остыть до комнатной температуры и аспирируйте старый буфер. Затем добавьте на клетки свежий буферный раствор, содержащий MPD.
Затем с помощью системы дозирования жидкостей нанесите на клетки различные концентрации исследуемых соединений и контрольных растворов. Инкубируйте клетки в 96-луночном планшете с исследуемыми соединениями в течение пяти минут перед проведением флуоресцентных измерений. В соответствии с данной процедурой поместите 96-луночный планшет в флуоресцентный планшетный ридер Biotech Synergy 2.
Зафиксируйте фоновый сигнал флуоресценции при длине волны возбуждения 520 nanometers и длине волны эмиссии 560 nanometers. Затем с помощью системы инжекторов Synergy two добавьте в лунки лиганды G PCR R или контрольный раствор для активации каналов GIR. После этого регистрируйте значения данных с интервалом в десять секунд в течение 302-секундного периода выборки.
На длинах волн возбуждения и эмиссии. Рассчитайте Z-фактор, чтобы определить надежность анализа. Z-факторы в диапазоне от 0,5 до 1,0 указывают на отличное качество анализа.
Планишки с Z-факторами ниже 0,5 исключаются. Соединения, модулирующие флуоресцентный сигнал, подвергаются повторному тестированию в присутствии 2 мM хлорида бария или 500 нM терапина Q для подтверждения специфичности к калиевым каналам внутреннего выпрямления; здесь представлен репрезентативный флуоресцентный сигнал HLB 0 2 1 1 15 2, измеренный с течением времени в клетках A TT 20 при добавлении соматостатина или контрольного раствора. Отношение интенсивности флуоресценции на оси Y рассчитывалось путем деления сигнала в присутствии соматостатина или контрольного раствора на базовый сигнал, измеренный до добавления соматостатина или контрольного раствора.
Здесь показана обработка клеток A TT 20 500 nM Terapin Q. Terapin Q ингибирует опосредованное соматостатином снижение флуоресцентного сигнала, связываясь с G-белками и блокируя G-каналы. Также здесь показана обработка клеток A TT 20 20 µM пропафенона, который также ингибирует опосредованное соматостатином снижение флуоресцентного сигнала. После освоения эта методика может быть выполнена за два часа при условии правильного проведения процедуры.
После просмотра этого видео вы должны будете хорошо понимать, как идентифицировать препараты, модулирующие каналы grk, с помощью флуоресцентного планшетного ридера.
Просмотрите полный транскрипт и получите доступ к тысячам научных видео
Обзор
В данной статье описывается процедура скрининга в режиме реального времени для выявления препаратов, взаимодействующих с G-белок-зависимыми калиевыми каналами внутреннего выпрямления (GIRK). В методе используются флуоресцентные красители, чувствительные к мембранному потенциалу, для измерения активности каналов GIRK, что делает его применимым для различных клеточных линий.
Основные компоненты исследования
Область науки
- Фармакология
- Нейробиология
- Электрофизиология
Теоретические основы
- Каналы GIRK играют важнейшую роль в нейрональной передаче сигналов.
- Идентификация модуляторов каналов GIRK может привести к разработке новых терапевтических стратегий.
- Анализы в режиме реального времени повышают эффективность скрининга лекарственных средств.
- Флуоресцентные красители обеспечивают чувствительный метод измерения активности каналов.
Цель исследования
- Разработать методику скрининга препаратов, модулирующих GIRK-каналы.
- Использовать высокопроизводительный формат для тестирования нескольких соединений.
- Углубить понимание фармакологии GIRK-каналов.
Используемые методы
- Посев клеток TT 20 в 96-луночный планшет.
- Использование системы обработки жидкостей Verset для разведения исследуемых соединений.
- Нанесение разведенных соединений на клетки с помощью системы Verset.
- Использование флуоресцентного планшетного ридера Synergy 2 для измерения показателей отклика.
Основные результаты
- Идентификация соединений, изменяющих сигналы, индуцированные соматостатином.
- Демонстрация возможности адаптации анализа к различным клеточным линиям.
- Успешная модуляция активности GIRK-каналов тестируемыми соединениями.
- Подтверждение эффективности флуоресцентного планшетного ридера при проведении скрининга.
Выводы
- Разработанный анализ является ценным инструментом для поиска лекарственных препаратов, воздействующих на GIRK-каналы.
- Скрининг в режиме реального времени может ускорить поиск потенциальных терапевтических средств.
- Необходимы дальнейшие исследования для изучения клинического значения выявленных соединений.
Часто задаваемые вопросы
Значимость для промышленности
Данный анализ позволяет осуществлять высокопроизводительную идентификацию модуляторов GIRK-каналов, что способствует валидации мишеней в нейробиологии и при поиске сердечно-сосудистых лекарственных препаратов. Обеспечивая количественные показатели флуоресценции в режиме реального времени, этот метод снижает зависимость от низкопроизводительной электрофизиологии и ускоряет переход от стадии поиска «хитов» к оптимизации соединений-лидеров. Данный метод повышает прогностическую достоверность на ранних этапах разработки, связывая эффекты соединений с функциональной активностью каналов в физиологически релевантном клеточном контексте.
Стратегическое применение в биофармацевтических исследованиях и разработках
Ранние этапы поиска и валидация мишени
- Научная ценность: Позволяет проверять терапевтические гипотезы путем измерения функциональной модуляции каналов GIRK в ответ на лиганды GPCR.
- Практическая ценность: Обеспечивает возможность быстрого скрининга библиотек соединений для идентификации активаторов или ингибиторов с механистической специфичностью.
- Прогностическая ценность: Способствует снижению рисков при выборе мишени, подтверждая целевую активность через изменения флуоресцентного сигнала, коррелирующие с выходом K+.
Скрининг и разработка анализа
- Готовность анализа: используются красители, чувствительные к мембранному потенциалу (DiBAC4(3) или HLB 021-152), для получения количественных сигналов в реальном времени при активации GIRK.
- Воспроизводимость: расчет Z-фактора (отличный диапазон: 0,5–1,0) обеспечивает надежность анализа для отбора хитов и воспроизводимость кампании.
- Масштабируемость: совместимость с 96-луночным форматом и системами автоматического дозирования жидкостей (например, Verset) для автоматизированного распределения соединений и скрининга.
Трансляционные и доклинические исследования
- Клиническая значимость: Выявленные модуляторы могут лечь в основу терапевтических стратегий лечения нейропатической боли, зависимостей и сердечных аритмий посредством GIRK-опосредованного торможения нейронов.
- Трансляционная преемственность: Флуоресцентные показатели обеспечивают связь между взаимодействием с мишенью и функциональным результатом, что способствует закреплению фенотипа на доклиническом этапе.
- Снижение механистических рисков: Специфичность подтверждается с использованием таких ингибиторов, как хлорид бария или Terapin Q, для дифференциации GIRK-опосредованных эффектов от нецелевой активности.
Интеграция конвейеров и рабочих процессов
Данный анализ вписывается в процесс разработки лекарственных средств — от валидации мишени до идентификации ведущих соединений, что позволяет проводить функциональный скрининг модуляторов GIRK перед последующей оптимизацией.
- Биологические исследования: Обеспечивают проверку гипотез путем установления связи между активацией GPCR и GIRK-зависимыми изменениями флуоресценции, что позволяет уточнить механизмы модуляции путей.
- Скрининг: Обеспечивает готовность анализа за счет стандартизированного введения красителя, нанесения соединений и измерения кинетики флуоресценции в течение 300 секунд.
- Аналитика: Позволяет получать количественные измерения зависимой переменной (отношение интенсивностей флуоресценции), что дает возможность сравнивать силу действия и эффективность соединений.
- Трансляционные исследования: Связывают метод с доклиническими работами путем идентификации соединений, изменяющих возбудимость нейронов через GIRK, что актуально для моделей боли и зависимости.
- Корпоративное повторное использование: Платформа адаптируема для различных клеточных линий и лигандов GPCR, что способствует её повторному применению в рамках нескольких кампаний по валидации мишеней.
Операционное и корпоративное влияние
- Научная ценность: обеспечивает прогностическую уверенность в модуляции мишени за счет снижения механистической неопределенности при скрининге препаратов для ионных каналов.
- Практическая ценность: обеспечивает стандартизацию, воспроизводимость и получение кинетических данных в режиме реального времени, что недостижимо при использовании конечных методов анализа.
- Стратегическая ценность: улучшает принятие решений о продолжении или прекращении разработки (go/no-go) за счет возможности ранней функциональной валидации, снижая риск неудач на поздних этапах из-за отсутствия взаимодействия с мишенью.
- Влияние на портфель: облегчает приоритизацию соединений с подтвержденной активностью GIRK с учетом рисков для дальнейшего перехода к этапу оптимизации ведущих соединений.
Особенности реализации
- Требуется опыт работы с культурами клеток (клетки AT T20), использование флуоресцентных красителей и работа с кинетическим планшетным ридером.
- Необходим флуоресцентный планшетный ридер с функцией инъекции (например, Synergy 2) и совместимыми настройками возбуждения/эмиссии (520 nm/560 nm).
- Необходима стандартизация загрузки красителя, времени инкубации и условий буфера во всех лунках и планшетах.
- Адаптация метода для других клеточных линий требует подтверждения экспрессии GIRK и эффективности загрузки красителя.
- Практическое ограничение: специфичность анализа должна быть подтверждена с помощью ортогональных ингибиторов (например, Ba2+, Terapin Q), чтобы исключить изменения флуоресценции, не опосредованные каналами GIRK.
