Профилирование Предварительно микро-РНК и микроРНК с использованием количественных ПЦР в реальном времени (КПЦР) Массивы

Общая цель данной процедуры — обеспечить быструю и надежную автоматизированную подготовку массивов на основе QPCR. Это достигается путем предварительного приготовления наборов праймеров для массива и подготовки мастер-миксов образцов для скрининга. Затем для точного распределения мастер-миксов образцов и наборов праймеров в каждую лунку 384-луночного планшета используется либо автоматизированная роботизированная система подготовки ПЦР, либо матричная электронная система дозирования.

После подготовки реакции ПЦР в 384-луночном планшете проводят с использованием программы ПЦР LightCycler 480. Заключительным этапом процедуры является анализ данных количественной ПЦР (кПЦР) и определение уровней относительной экспрессии для каждой протестированной пары праймеров, каждая из которых нацелена на специфическую мРНК. В конечном итоге можно получить результаты, демонстрирующие изменения в экспрессии больших наборов мРНК.

Таким образом, специально разработанные массивы позволяют с помощью профилирования на основе QPCR анализировать полные профили пре-микроРНК, специфические сигнальные пути или молекулы, играющие ключевую роль в вирусной инфекции. Здравствуйте, я Дирк DMA с кафедры микробиологии и иммунологии Университета Северной Каролины в Чапел-Хилл. Сегодня мы покажем вам, как настроить количественную ПЦР (QQPC rra) в режиме реального времени, и продемонстрируем два метода.

Одна с использованием обычной пипетки, другая — с помощью робота. Мы применяем эту технологию для измерения уровней пре-микроРНК и зрелых микроРНК в опухолях человека. Сегодняшнюю демонстрацию проведут Полин Чу и Кристен Бу.

Итак, приступим. Для начала данной процедуры возьмите планшеты с праймерами, содержащие 186 пар праймеров в 96-луночном формате в концентрации 0.5 pM, хранящиеся при температуре -20 °C.

После размораживания планшетов при комнатной температуре их следует коротко перемешать на вортексе и центрифугировать. Также разморозьте при комнатной температуре ПЦР-смесь Cyber Green 2X; для подготовки каждого планшета с праймерами на 96 лунок потребуется четыре пробирки с мастер-миксом. Приготовьте мастер-микс, объединив в каждой из четырех пробирок типа «эппендорф» объемом 2 мл четыре мкл смеси Cyber Green, три мкл воды для ПЦР и от 10 до 20 нг образец ДНК или кДНК на одну реакцию.

Каждая пробирка должна содержать достаточное количество мастер-микса примерно для 100 реакций, с учетом избытка на потери при пипетировании. Перемешайте содержимое пробирок на вортексе. Начните подготовку анализа предшественников микроРНК с использованием робота freedom Tecan EVO, инициализировав робота и загрузив программу EVO wear.

Затем трижды промойте робот 30 миллилитрами системной жидкости, чтобы удалить из системы пузырьки воздуха, которые могут повлиять на точность дозирования. Далее настройте платформу робота, установив планшет на 384 лунки и планшет с праймерами на 96 лунок. Также установите кювету с 2% раствором гипохлорита натрия для мастер-миксов, заполненный контейнер с системной жидкостью и пустой контейнер для отходов.

Запустите автоматический цикл работы робота, дважды выбрав команду run в конце программы. Извлеките планшет на 384 лунки и загерметизируйте его с помощью фольги для термоциклера 80 ceiling foil. Затем центрифугируйте планшет.

Кратковременно поместите запечатанный 384-луночный планшет в первую позицию стеллажа. Затем повторите этот процесс для второй планшеты с праймерами, используя новые мастер-миксы и новый 384-луночный планшет. Поместите полученный запечатанный 384-луночный планшет во вторую позицию стеллажа.

Откройте новую программу EVO wear для загрузки амплификатора из накопителя («отеля») и установите параметры циклирования. Затем дважды выберите команду «запуск» (run). Система Freedom Evo автоматически загрузит каждую планшетку в амплификатор и выполнит программу HRM-циклирования для красителя Cyber Green.

По завершении процесса проверьте и проанализируйте результаты, как описано в письменном протоколе, в качестве альтернативы использованию робота. Для переноса содержимого первой пробирки с мастер-миксом в резервуар можно использовать многоканальный электронный дозатор для работы с матричными планшетами.

Настройте электронный дозатор на забор 16 µL мастер-микса с двумя этапами выдачи по 8 µL и последующим этапом продувки. После настройки дозатора заберите 16 µL мастер-микса и начните раздачу в 384-луночный круглый планшет. Раздайте первые 8 µL через одну строку в первой колонке (строки от A до O), оставив следующую колонку пустой.

Перенесите следующие 8 µL в те же ряды третьего столбца. Затем удалите остатки жидкости над контейнером для отходов и замените наконечники, следуя этой схеме пропуска через ряд и столбец. Повторите процедуру еще пять циклов по всей планшете для дозирования мастер-микса два.

Используйте те же строки, что и для первой мастер-смеси, но начните со второго столбца. Повторите эту процедуру для третьей и четвертой мастер-смесей, начиная с первого и второго столбцов соответственно, но на этот раз используя ряды B–P планшета с праймерами. Настройте электронный дозатор на забор 2 µL и выдачу 2 µL с последующим продувом.

Перенесите по 2 µL праймеров из столбца 1 (ряды с A по H) 96-луночного планшета с праймерами в каждую вторую лунку первого столбца 384-луночного планшета, сбрасывая остатки в контейнер для отходов, после чего утилизируйте наконечники. Повторите эту процедуру для остальных трех мастер-смесей праймеров в столбцах 1 и 2. Затем продолжите этот процесс для столбцов со 2 по 12 96-луночного планшета с праймерами, перемещаясь через каждые два столбца в 384-луночном планшете для каждого столбца праймеров.

Затем закройте планшеты крышкой амплификатора, загерметизируйте фольгой и центрифугируйте. Сразу после центрифугирования поместите планшеты в амплификатор Four 80 и проведите циклическое амплифицирование, используя формат детекции HRM с красителем Cyber Green I.

Используя те же условия циклирования, что и ранее, повторите эту процедуру, используя вторую планшету с праймерами Eloqua в новом 384-луночном планшете со свежеприготовленными мастер-миксами. Сигнатуры микроРНК-предшественников выявляются путем профилирования с использованием нового массива на основе QPCR. Было рассчитано среднее значение delta CT, нормализованное по U6, и стандартизированные значения были внесены в массив.

Программное обеспечение Minor, позволившее выделить три отдельных кластера, представленных в виде тепловых карт. Относительная экспрессия каждой микроРНК-предшественника показана цветом: красный и синий цвета обозначают увеличение и снижение относительной экспрессии соответственно. Интенсивность цвета указывает на степень изменения экспрессии.

Большинство предшественников микроРНК претерпели незначительные изменения, как и ожидалось. Однако уровень небольшой части предшественников микроРНК существенно повысился в течение всего эксперимента. Кроме того, относительный уровень некоторых предшественников микроРНК резко снизился.

В некоторых случаях они также группируются вместе при анализе тепловой карты. В зависимости от эксперимента могут появиться кластеры, зависящие от вирусной инфекции, специфической для определенного типа клеток экспрессии предшественников микроРНК или предшественников микроРНК, которые регулируются общей молекулой или сигнальным путем.

Представлены средние пороговые циклы (Ct) для отрицательного образца на вирус герпеса, ассоциированный с саркомой Капоши, при проведении анализа в четырех повторах. Важно отметить, что ядерный антиген, ассоциированный с латенцией вируса герпеса, ассоциированного с саркомой Капоши (KSHV Lana), не был обнаружен в данном образце с помощью высокочувствительной системы QPCR array. Тем не менее, и внутренний контроль U6, и let-7a (высокоэкспрессируемая человеческая предшественница микроРНК) экспрессировались на определяемых уровнях.

Наконец, как и ожидалось, в отрицательном контроле с использованием воды для ПЦР продукт A-Q-P-C-R не образовался. Показан анализ кривой плавления для двух разных праймеров с использованием одного и того же дубликата пробы.

Очевидно, что температура плавления различается для двух пар праймеров, однако образец плавится при одной и той же температуре для каждой повторности. Признаками некачественного или потенциально загрязненного образца могут быть несколько пиков плавления, что указывает на наличие двух разных источников исходного материала. Мы только что продемонстрировали вам, как организовать эксперименты по количественной ПЦР в реальном времени с использованием робота.

Важно включить все контроли и как можно больше генов домашнего хозяйства. Спасибо за просмотр и удачи в ваших экспериментах.