Выполнение пользовательских Эксперименты Microarray микроРНК

Общая цель данной процедуры заключается в проведении эксперимента с использованием микрочипа микроРНК. Это достигается путем предварительного получения напечатанных предметных стекол микрочипа, содержащих библиотеку зондов микроРНК, и подготовки образцов РНК надлежащего качества и количества. Затем образцы РНК и контрольного образца ДНК маркируются флуоресцентными красителями.

Затем меченые нуклеиновые кислоты добавляют на микрочиповый предметное стекло для гибридизации. В завершение предметное стекло промывают, сканируют и подвергают регенерации. В конечном итоге можно получить результаты, демонстрирующие общегеномную экспрессию микроРНК путем анализа интенсивности гибридизации отдельных зондов к микроРНК на предметном стекле.

Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы в области экспрессии генов, например, о том, как нормальные физиологические или патологические состояния дифференциально влияют на экспрессию микроРНК в глобальном масштабе. Качество изготовления микрочипа является одним из наиболее критических факторов успеха эксперимента с использованием микрочипа. После выделения РНК методом, который сохраняет малые РНК, и её ресуспендирования до концентрации, равной или превышающей 2 mg/mL, проведите маркировку РНК в реакционной смеси объемом 20 µL, предварительно смешав около 25 µg общей РНК с 0.5 µg 5'-PCU-DY-5 4 7 3' в 1X HEPs буфере с добавлением T4 RNA Ligase 1D TT и ATP. Если доступно меньшее количество РНК, пропорционально уменьшите количество РНК и объем реакции.

Если концентрация РНК очень низкая, добавьте носитель, такой как дрожжевая тРНК, для облегчения осаждения, и инкубируйте реакционную смесь на льду в холодильнике от 2 до 24 часов. Затем добавьте ацетат натрия до достижения концентрации 0,3 M, далее добавьте три объема этанола и осадите РНК в течение ночи при температуре -20 °C. При первом использовании предметных стекол проведите их предварительную гибридизацию в фильтрованном растворе 3X SSC, 0,1% SDS и 0,2% BSA в течение 30–60 минут при 37 °C.

Затем несколько раз погрузите предметные стекла в воду. После этого поместите их в изопропанол и высушите с помощью центрифуги с адаптером для предметных стекол при 100 ×g в течение пяти минут при 22 °C. Промойте полоски-лифтеры в воде.

Затем, в этаноле перед высушиванием на воздухе, поместите предметное стекло в основание камеры для гибридизации микрочипа, а сверху на стекло положите прижимное покровное стекло так, чтобы оно закрывало область с зондами и белые полоски. В темноте прижмите стекло, центрифугируйте осадок меченой РНК, один раз промойте его 70% ethanol и высушите осадок на воздухе. Осадок должен иметь красноватый цвет.

Приготовьте гибридизационный раствор, используя очищенную меченую референсную ДНК в объеме от 1/15 до 1/100 от объема на один образец РНК. Полностью растворите осадок РНК, добавив примерно 60 µl гибридизационного раствора, чтобы предотвратить высыхание раствора для гибридизации. Во время инкубации добавьте по 20 µl воды в каждую увлажняющую лунку в основании камеры для гибридизации на микрочипе.

Нанесите смесь меченой РНК и референсной ДНК на предметное стекло. С помощью тонкого наконечника пипетки осторожно коснитесь края прикрывного стекла и, используя всасывание, позвольте раствору проникнуть в пространство между прикрывным стеклом и предметным стеклом.

Установите крышку гибридизационной камеры на основание. Затем зафиксируйте камеру с помощью металлических зажимов. Поместите всю камеру в пластиковый пакет, который идет в комплекте с кассетой камеры.

Наконец, поместите кассету с камерой в контейнер с влажным бумажным полотенцем. Затем накройте контейнер пищевой пленкой и поместите его в увлажненный инкубатор для культур клеток при температуре 37 °C примерно на 24 часа. Для обработки предметных стекол после гибридизации поочередно разберите кассеты с камерами, погружая каждое предметное стекло и соответствующий приподнимающий покровный слой в 2X SSC при температуре 22 °C.

Подъемник-слип естественным образом соскользнет со стекла; промойте стекла дважды в 0,8 XSSC, затем трижды в 0,4 XSSC, затратив в общей сложности от одной до двух минут. Высушите стекла с помощью центрифуги с адаптером для стекол. Затем просканируйте стекла на микроматричном сканере и используйте такую программу, как blue fuse, для количественного определения интенсивности в файлах изображений.

Осмотрите отдельные пятна, чтобы исключить аномальные пятна, которые обычно возникают из-за печати на пористых стеклах или при работе со стеклами после гибридизации. Для анализа и представления данных используйте такие программы, как GeneSpring и Excel, чтобы повторно использовать микрочип. Очистите стекло, промыв его в воде, затем погрузив в кювету для окрашивания с предварительно нагретым 1 мM NaOH и 0,1 XSSC при 62 °C на 10–20 минут.

Повторите инкубацию второй раз. Несколько раз промойте предметные стекла в воде в течение до 60 минут при осторожном встряхивании при 22 °C. Высушите предметные стекла с помощью центрифуги и храните при 22 °C.

Слайды можно использовать без предварительной гибридизации. На данном рисунке представлено сканированное изображение микрочипа, демонстрирующее очень точные и сильные сигналы гибридизации. Красные пятна возникли в результате гибридизации референсной ДНК, зеленые пятна — из образца РНК, меченного DY 5 47, а желтые пятна — в результате гибридизации как ДНК, так и РНК с одними и теми же зондами.

Коэффициенты корреляции Пирсона между техническими повторами гибридизации микрочипов составляют около 0,99, что указывает на отличную воспроизводимость. После просмотра этого видео вы должны получить четкое представление о том, как проводить эксперимент с использованием пользовательского микрочипа не только для количественного определения микроРНК, но и для анализа других типов нуклеиновых кислот, таких как мРНК.